PCR试剂盒的选用和质检
15-刘义庆-PCR试剂盒选用和质检_15
临床PCR试剂、耗材的选用和质检刘义庆山东省立医院临床医学检验部Kary Mullis PCR 技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于1985年发现并研制成功。
Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。
原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。
经过若干循环后使目的DNA得以迅速扩增。
PCR技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。
目前，临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒。
●PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而且是至关重要的●试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的质量有决定性的影响●如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？●如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量?PCR或RT-PCR试剂盒的组成●核酸提取试剂●核酸扩增或逆转录－核酸扩增试剂●产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR 方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）影响PCR试剂盒质量的因素内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存影响PCR试剂盒质量的因素：核酸扩增所需的原材料●寡核苷酸引物●扩增缓冲液●dNTP●Taq酶以及反转录酶等寡核苷酸引物和探针●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响：纯度的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化。
另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。
●引物和探针的结合特异性：应减少假阳性或假阴性的出现扩增缓冲液和dNTP●缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.3~8.8)，KCl或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或DTT●Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增●四种dNTP的终浓度应相等Taq酶以及反转录酶●酶的浓度：酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低。
医院PCR试剂的质检标准操作程序
医院PCR试剂的质检标准操作程序
1 目的
保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合。
2 适用范围
各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂（现仅包括HBV、HCV、TB、CT试剂盒）。
3 操作人
XXX
4 操作步骤
4.1由本院的采购中心负责向三证[营业许可证、经营许可证（如为厂家则有生产许可证）、注册证]齐全的公司采购合格的产品。
4.2收到试剂后检查其是否处于冰冻状态，包装是否有破损。
4.3及时将试剂按照其说明书转移到相应的地方保存。
5 本SOP的变动程序
本SOP的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，
报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
PCR实验室耗材质检1
PCR实验室耗材质检一、耗材质检的原则耗材的质检通常是在新一批的耗材到实验室后统一做一次或者定期（半年或1年）做，因而质检就包含了验货和质检2个局部。
由于耗材的质检没有一个统一的规范，普通由各实验室自行制定，可简可繁，这里提出一些办法供大家参考。
1.外包装检查：外包装应完好无损无污，标识分明，检查品名、品牌，货号，规格、消费日期，有效期、保管条件等信息。
2.内包装检查：内包装物品应与外包装标识分歧，检查能否有破损，走漏，内容物能否齐全，能否有相应的运用阐明书等。
3.性能质检：检测试剂耗材能否与其性能分歧，比方吸头的精确性和气密性等4.污染物质检：检测试剂耗材能否被常规检测项目的待检物污染，这种污染可能是物品消费环节，也可能是运输或实验室的保管过程中被污染。
5.抑止物质检：检测试剂耗材中能否存在PCR的抑止物，比方核酸酶。
二、耗材质检的条件1.弱阳性质控：需求准备弱阳性质控，包括规范物质、第三方质控或弱阳性样品用于停止性能质控和抑止物质控。
2.阴性质控：需求准备肯定阴性的样品或空白对照，用于停止污染物的质控。
三、常见耗材的质检耗材的质检应分离实践工作中可能用到的场景，并非越苛刻越好，需求每个实验室分离本身状况来设计和调整文中提到的参数。
离心管（1）渗漏密闭性：将n个离心管参加半量墨汁，盖好盖子后放入水中，浸泡30min，没有墨汁渗出为合格。
（2）离心密闭性：将n个离心管参加半量纯水，放入离心机，10000 rpm，30min，管盖未崩开未漏液为合格。
（3）热密闭性：将n个离心管参加半量纯水，盖好盖子称重后放入金属浴中，65℃或90℃（巴氏消毒），30min，再停止称重，离心管未变形，管盖未崩开未漏液，前后重量未变化为合格。
（4）冷密闭性：将n个离心管参加半量纯水，放入-20℃冰箱，24h，离心管未变形，管盖未崩开未漏液为合格。
（5）污染物质检：将n个离心管分别参加半量阴性纯水，盖好盖子涡旋 1 min后静置5min，汲取纯水作为模板停止扩增，qPCR无扩增为合格。
pcr检测实施方案
pcr检测实施方案PCR检测实施方案。
PCR（聚合酶链式反应）是一种用于复制和扩增DNA片段的技术，广泛应用于医学、生物学、法医学等领域。
在疾病诊断和病原体检测中，PCR检测技术已成为一种重要的手段。
本文将介绍PCR检测的实施方案，包括样本采集、试剂准备、实验操作等内容，以帮助实验人员正确、规范地进行PCR检测。
一、样本采集。
1. 样本选择，根据需要检测的疾病或病原体类型，选择相应的样本类型，如血液、唾液、组织等。
2. 采集器具准备，准备好采血针、采血管、采集棉签等采集器具，并确保无菌。
3. 采集操作，按照标准操作程序，采集样本，并尽量避免污染和误差。
二、试剂准备。
1. PCR试剂准备，根据实验需要，准备好PCR反应体系所需的试剂，包括引物、酶、缓冲液等。
2. 试剂保存，按照说明书要求，正确保存PCR试剂，避免冻融、阳光直射等不良影响。
三、PCR反应。
1. 反应体系配置，根据所需扩增片段的大小和数量，配置PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA浓度、缓冲液浓度等。
2. 反应管标记，在反应管上标记好样本编号和实验日期，避免混淆。
3. 反应条件设定，根据引物特性和模板DNA特性，设定PCR反应的温度、时间等条件。
4. PCR反应操作，按照设定的条件，进行PCR反应，确保操作准确、无污染。
四、扩增产物检测。
1. 凝胶电泳，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，观察扩增片段的大小和纯度。
2. 实时荧光定量PCR，对于定量检测，可使用实时荧光定量PCR技术，准确测定扩增产物的数量。
五、结果分析。
1. 结果解读，根据扩增产物的大小、数量和纯度，结合实验目的，进行结果分析和解读。
2. 数据记录，将实验结果详细记录在实验笔记或实验报告中，便于日后查阅和复现实验。
六、实验安全。
1. 实验操作安全，在实验操作过程中，严格遵守实验室安全操作规程，避免实验意外发生。
2. 废弃物处理，实验结束后，将废弃的试剂、反应管等废弃物按规定处理，保持实验室环境整洁。
检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则
检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则1、目的规范了本中心荧光定量PCR检测试剂盒的验收方法，以确保检测试剂盒的质量符合检测技术的要求；确保检测结果的准确、有效。
2、使用范围适用于本中心荧光定量PCR检测试剂盒的验收。
3、职责由动物疫病监测室相关人员负责荧光定量PCR试剂盒的验收。
4、验收内容4.1 荧光定量PCR检测试剂盒选用规定荧光定量PCR检测试剂盒的选用以政府招标的方式进行，由具有相关资质的供应商提供试剂盒。
所提供的试剂盒的保质期必须在半年以上，否则予以退货。
每一批号检测试剂盒都必须进行验收，符合要求后方可使用4.2 验收标准及方法4.2.1 荧光定量PCR检测试剂盒的验收按照《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》（GB/T19438.2-2004）与《新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法》（SN/T1686-2005）中的规定执行。
试剂盒中提供的试剂有荧光RT-PCR反应液、转录酶、反转录酶和Taq 酶。
验收指标就是使用试剂盒的反应体系，按照GB/T19438.2-2004中的反应程序，使质控阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线。
4.2.2 主要使用仪器荧光定量PCR扩增仪，生物安全柜4.2.3 验收步骤按照GB/T19438.2-2004以及SN/T1686-2005中的规程对质控阴、阳性对照进行核酸提取，再进行荧光RT-PCR反应。
质控阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线。
这两个参数同时满足，表明试剂盒符合要求，可以使用。
5、相关记录FNAJ/BG-B-406-05 日常采购（包括易耗品）验收记录表GB/T19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法SN/T1686-2005 新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR 法。
pcr 试剂和耗材质检内容
pcr 试剂和耗材质检内容
PCR试剂和耗材的质检内容是确保其质量和性能符合要求，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
以下是PCR试剂和耗材的一些常见质检内容：
1.成分分析：对PCR试剂和耗材的成分进行分析和检测，确
保其中所含的引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs等物质的纯
度和质量符合标准要求。
2.活性检测：检测PCR试剂中的聚合酶活性，以确定其是否
能够有效地扩增DNA。
常用的方法包括通过引物扩增模板
DNA，并使用凝胶电泳检测扩增产物。
3.纯度检测：检测PCR试剂和耗材的纯度，确保其中不含有
污染物。
例如，对DNA模板进行纯度检测，如比例计算
A260/A280和A260/A230的比值。
4.储存条件评估：评估PCR试剂和耗材的保存和储存条件，
包括温度、湿度等，以确保其在储存期间的稳定性和性能
不受影响。
5.包装和密封性检测：检查PCR试剂和耗材的包装和密封性，
确保其在运输和储存过程中不受损。
6.结果验证：进行PCR反应，并验证其结果的准确性和可靠
性。
可以通过扩增特定的DNA片段，然后使用凝胶电泳
等方法检测和验证PCR反应的生成物。
这些质检内容旨在确保PCR试剂和耗材的质量和性能符合标准
要求，以使其能够在实验中达到预期的效果和准确性。
质检的结果对于选择和使用合适的PCR试剂和耗材非常重要，并有助于确保实验结果的可靠性。
PCR产物纯化试剂盒(离心柱型)
PCR产物纯化试剂盒（离心柱型）GK2051 50次GK2052 100次一、试剂盒组成Components GK2051 (50次）GK2052 (100次)DNA Recovery Column 50个100个2-ml Collection Tube 50个100个Binding Solution 25ml 50 mlWash Solution (1)12ml 24 mlElution Buffer (2)10ml 20mlProtocol 1 copy 1 copy二.产品特点1. 应用范围广：去除PCR反应体系以及各种反应体系(如酶切体系,连接体系等)中的dNTPs，多余的引物，缓冲体系和酶等，也可用作DNA的浓缩和纯化。
2. 快速简便、节省时间：无需酚-氯仿抽提，不含乙醇沉淀步骤，整个纯化过程约需 15min。
三.注意事项1.如果PCR反应体系含有非常多的非特异性条带，建议使用Gel Recovery Column柱式胶回收试剂盒(GK2041/2042)。
2.该试剂盒不能去除PCR反应体系中的双链DNA模板以及长度大于50bp的单链引物。
四.实验准备1.首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。
每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
如果发现Wash Solution由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。
2.Elution Buffer为2.5mMTris-HCl（pH8.5）。
TE（pH8.0）或者去离子水（pH>7.0）均可以使用，但是DNA的洗脱效率通常要低20%左右。
五.操作步骤1. PCR反应结束后，从PCR反应管中将反应液移至干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的BindingSolution ，上下颠倒混匀。
注意：一般情况下采用50-100ul的PCR反应液进行PCR产物纯化，如果欲纯化的PCR反应液体积不足50ul，请加入灭菌的双蓁水补足到50ul。
PCR试剂盒的选用和质检
是否有污染。
结合特异性（浓度）
dNTP和缓冲液
dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度
本章共七条。 实验室分区：规范化分区、明确的识别标记 防污染：空气流向、中央空调、各区间的封闭性 各区仪器设备物品配备：充分性、科学性、专用
性（标识） “生物安全柜” “可移动紫外灯” “加样器”
设施和环境
本章包括五条； 实验室设施、工作区域、能源、照明等； 环境和实验条件控制设施：温湿度计、不间断
核酸提取的有效性 核酸提取的简便性
影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测
杂交固相
特异探针及其标记物
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计
外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因 素：试剂盒的运输和贮存
试剂盒的运输和贮存
PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是 指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分 的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测 部分试剂则贮存于2～8℃。
试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运 输及运输中的贮存，任一环节的不当， 均会影响试剂盒的临床使用质量。
PCR试剂盒的分类
定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交 （杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等）
定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和 Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。
临床PCR试剂盒的选用和质检
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逆转录酶、DNA聚合酶
酶的浓度 酶的活性
核酸扩增方法
PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA） 连接酶链反应（LCR） 链替代扩增（SDA）等
影响PCR试剂盒质量的因素： 核酸提取
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
血清盘结果 ＋
待检试剂盒 结果＋
血清盘结果 － b d b+d
合 计 a+b c+d a+b+c+d
a c a+c
待检试剂盒 结果－ 合 计
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
灵敏度（％）＝ (a / a+c)100% 特异性（％）＝ (d/b+d) 100% 符合率（％）＝ பைடு நூலகம்a+d/a+b+c+d) 100%
影响PCR试剂盒质量的因素： 扩增所需的原 材料
寡核苷酸引物和探针 缓冲液和dNTP
聚合酶、逆转录酶等
PCR反应混合物
Mg Mn
2+
和 或
Taq DNA 多 聚 酶 rTth DNA 多 聚 酶 AmpEras e 生物素标记的引 物
2+
和
dCT P dGT P dUT P dATP
寡核苷酸引物和探针
临床PCR试剂盒的选用和质检
卫生部临床检验中心 李金明
PCR或RT-PCR试剂盒的组成
核酸提取试剂
核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂
产物检测试剂（有些使用全自动分析仪 的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成， 故无专门的产物检测试剂）
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计
其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯 度的判断可根据260/280吸光度比值来判 断，如‹2.0，则需重新纯化。另一种方法 是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出 现一条以上的带或迁移位置错误，则需 重新纯化。 是否有污染。 结合特异性（浓度）
dNTP和缓冲液
dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度
PCR试剂盒的质检
外包装：厂家名称、检测目的、批准文 号、批号和有效期等。
内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是 否破损以、试剂是否齐全以及是否有使 用说明书等。
PCR试剂盒的质检
采用血清（样本）盘（Panel）质检： PCR 试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、 阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或 cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所 组成。样本总数可定在20份左右。 原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸 检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样 本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的 有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测 定下限。
核酸提取的有效性 核酸提取的简便性
影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测
杂交固相 特异探针及其标记物
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计 外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因 素：试剂盒的运输和贮存
试剂盒的运输和贮存
PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是 指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分 的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测 部分试剂则贮存于2～8℃。 试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运 输及运输中的贮存，任一环节的不当， 均会影响试剂盒的临床使用质量。
PCR试剂盒的分类
定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交 （杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等） 定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和 Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCRELISA定量等。
PCR试剂盒的选用原则
参考试剂生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价 根据使用目的 根据所在实验室的技术特点 根据所在医院患者的承受能力
谢 谢!