基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响
基于16S_rDNA_高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用
846 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5㊃基础研究㊃基金项目:福建省自然科学基金面上项目(2020J01724);福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2019⁃ZQN⁃82);福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2021R1003001)作者单位:350122 福州,福建中医药大学针灸学院[王婧雯(硕士研究生)㊁林晟];福建省中医药科学院经络研究所福建省经络感传重点实验室(郑淑霞㊁许金森)作者简介:王婧雯(1995-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:wjw951201@通信作者:许金森(1963-),硕士,研究员,博士生导师㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:xujinsenjls@基于16S rDNA 高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用王婧雯 郑淑霞 林晟 许金森【摘要】 目的 采用16S rDNA 高通量测序技术,分析电针足三里对腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)大鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响,探讨电针对IBS⁃D 的作用机制㊂方法 将SD 大鼠随机分为空白组㊁模型组㊁电针组㊂采用束缚联合番泻叶煎剂灌胃法造模,电针组采用电针双侧足三里干预,空白组与模型组不做干预处理㊂干预结束后,检测大鼠内脏敏感性,并取大鼠粪便进行16S rDNA 高通量测序技术检测大鼠肠道菌群㊂结果 (1)与空白组比较,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P <0.05);经过电针治疗后,在20mmHg 压力下的腹壁回撤反射评分明显降低(P <0.05)㊂(2)与空白组相比,模型组OTU 数目明显降低,电针组接近于空白组㊂(3)与空白组相比,模型组芽孢杆菌纲㊁乳杆菌属㊁真杆菌属等丰度明显降低,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲㊁毛螺菌属等丰度明显升高,而电针组上述菌纲/属丰度均有所改善㊂(4)三组的Beta 多样性分析结果显示,模型组与空白组的样本明显被区分开,而电针组则在两组之间㊂结论 IBS⁃D 与内脏高敏感性以及肠道菌群结构紊乱有关,电针能调节IBS⁃D 大鼠内脏敏感性以及肠道菌群物种相对丰度,改善菌群多样性㊂【关键词】 16S rDNA 高通量测序; 电针; 腹泻型肠易激综合征; 肠道菌群; 足三里; 内脏敏感性【中图分类号】 R245 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.05.005Regulatory effect of electropuncture on gut microbiota of rats with IBS⁃D based on 16S rDNA high⁃throughput sequencingWANG Jingwen ,ZHENG Shuxia ,LIN Sheng ,XU JinsenCollege of Acupuncture and Moxibustion ,Fujian University of Traditional Chinese Medicine ,Fuzhou 350122,ChinaCorresponding author :XU Jinsen ,E⁃mail :xujinsenjls@【Abstract 】 Objective To analyze the effect of electroacupuncture at zusanli on the relativeabundance and diversity of gut microbiota in rats with irritable bowel syndrome⁃diarrhea (IBS⁃D)by 16SrDNA high⁃throughput sequencing and explore the mechanism of action of electroacupuncture on IBS⁃D.Methods The SD rats were randomly divided into a blank group,a model group,and anelectroacupuncture group,and IBS⁃D rat model was established by chronic restraint stress combined withsenna.The electroacupuncture group took the double⁃sided zusanli point for electroacupuncture环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5847 intervention,and the blank group and the model group were not treated with any treatment.After the inter⁃vention,the levels of visceral sensitivity were tested and rat feces were taken for16S rDNA high⁃throughput sequencing technology to detect the gut microbiota of rats.Results (1)Compared with the blank group,The AWR socre of rats in the model group was significantly increased(P<0.05);after electroacupuncture treatment,the AWR score at20mmHg pressure was significantly decreased(P<0.05).(2)Compared withthe blank group,the number of OTU in the model group was decreased significantly,and the electroacupuncture group was close to the blank group.(3)Compared with the blank group,the abundance of Bacilli,Lactobacillus and eubacterium⁃coprostanoligenes_group in the model group was de⁃creased,and the abundance of Bacteroidia,Clostridia,Deltaproteobacteria,and lachnospiraceae_nk4a136_group were significantly increased,while the abundance of the above⁃mentioned class/genus inthe electroacupuncture group was improved.(4)The results of the beta diversity analysis of the threegroups showed that the samples of the model group and the blank group were clearly distinguished,whilethe electroacupuncture group was between the two groups.Conclusion IBS⁃D is associated with high sensitivity of internal organs and disorders in the structural of gut microbiota,and electroacupuncture canregulate the visceral sensitivity and the relative abundance of gut microbiota species in IBS⁃D rats andimprove the diversity of microbiota.【Key words】 16S rDNA high⁃throughput sequencing; Electroacupuncture; Irritable bowel syndrome⁃diarrhea; Gut microbiota; ST36(Zusanli); Visceral sensitivity 腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)是一种反复发作㊁缠绵不愈的慢性功能性肠病,其在临床上的特征主要是腹泻㊁腹痛或腹部不适,根治较难㊂目前了解到的发病机制有胃肠功能紊乱㊁脑肠轴紊乱㊁内脏高敏感性㊁肠道菌群失调等㊂有研究发现,肠道菌群失调与IBS⁃D的发生发展关系密切,IBS⁃D患者的肠道菌群与正常人相比存在明显差异,常表现为有益菌减少,有害菌增多[1]㊂临床在治疗IBS⁃D时采取了很多方法,然而效果却不尽如人意,针灸以其安全有效简便的优点在众多治疗方法中崭露头角㊂近几年的研究发现,电针不仅可以改善IBS⁃D患者的各项症状[2],降低内脏高敏感性[3⁃4],而且对于改变肠道菌群结构也有一定帮助[5],但是对于其中具体的分子机制仍存在疑惑㊂课题组前期研究已经表明电针对于IBS⁃D大鼠具有良好的治疗效果,能够缓解大鼠症状,且对于辣椒素受体(TRPV1)以及蛋白酶激活受体⁃2(partition defective protein⁃2,PAR⁃2)通路有影响,但具体对大鼠肠道菌群的影响没有做出研究,故本研究拟在前期研究基础上,从肠道菌群角度探讨电针足三里治疗IBS⁃D的机制㊂1 材料与方法1.1 动物选用体质量为(200±20)g雄性SPF级SD大鼠25只,由杭州医学院提供[许可证号:SCXK (浙)2019⁃0002],于福建省中医药科学院实验动物中心饲养㊂饲养条件:室温26℃左右,湿度60%左右,自由饮食,适应性喂养一周后开始实验㊂本实验严格按照‘实验动物管理条例“等文件要求进行㊂1.2 仪器㊁设备R407型小动物呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技公司)㊁电针仪(华佗牌SDZ⁃Ⅱ型)㊁0.25×13mm 的毫针(北京汉医医疗器械有限公司)㊂1.3 实验药品和试剂番泻叶饮片(豪州市华鑫中药饮片科技有限公司)㊁异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)㊁0.9%氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司)㊂1.4 动物分组及处理按照随机数字表法将大鼠分为正常组8只㊁模型组8只㊁电针组9只㊂正常组不做处理,正常饮水进食;模型组和电针组进行为期两周的造模后,对电针组做电针干预处理,模型组做同等抓取,不做电针处理㊂1.5 模型制备采用慢性束缚应激联合番泻叶灌服法进行造模[6⁃7],具体操作方法:动物实验前10小时禁食不禁水,先给予番泻叶煎剂(0.3g/mL)灌胃给药(10mL/kg),每日1次,连续灌胃14天㊂灌服完番泻叶煎剂后,即用自制铁丝网将大鼠固定1小时,期间限制大鼠活动,每日1次,持续14天㊂848 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.51.6 干预方法造模结束后,电针组选择双侧 足三里”穴进行针刺干预㊂参照‘实验动物针灸穴位图谱“进行定位,选取位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处的 足三里”穴㊂具体方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴区,用0.25mm×13mm毫针直刺,深度5mm,进针后不需要进行手法刺激,连接电针仪进行治疗,设置连续波[8],频率2Hz,电压2~5V,强度以大鼠不嘶叫为宜,电针20分钟,左右足三里交替进行,每日1次,连续5天㊂1.7 内脏敏感性检测检测前,大鼠禁食不禁水18小时,给予异氟烷麻醉各组大鼠后,用自制工具(三通管连接自制球囊㊁血压计㊁针筒)进行检测㊂在球囊上涂充足的液体石蜡后将球囊缓慢插入大鼠肛门约4.5cm处,然后把大鼠放进自制的20cm×8cm×8cm大小的亚克力透明盒中㊂等待大鼠完全清醒后,约30分钟左右检测大鼠的内脏敏感性㊂测量腹壁回撤反射评分(abdominal withdrawa reflex,AWR)时由针筒向球囊内注入空气,使血压计读数短时间内分别达到20㊁40㊁60㊁80mmHg㊂不同容积的压力每个持续20秒,重复3次㊂AWR评分标准[9]:0分,无明显行为变化;1分,大鼠身体不动或仅有简单的头部运动;2分,大鼠腹部肌肉开始收缩;3分,大鼠下腹壁抬离地面或明显收缩变平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身体㊁骨盆躬起,臀部抬离地面㊂1.8 样本采集与指标检测干预结束后,大鼠禁食不禁水18小时,用高温烘烤过的手术器械进行操作㊂先将大鼠放入小动物呼吸麻醉机诱导盒中使其吸入异氟烷后至麻醉状态,接着于冰上迅速剪开大鼠的结肠组织,将留存在大鼠肠道内的粪便取出1到2颗装入备好的无酶EP管内,随后置于液氮中保存㊂实验结束后,将取材得到的大鼠粪便采用16S rDNA高通量测序技术进行肠道菌群的检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成㊂基本流程:从样品中提取总基因组DNA,进行16SrDNA区段扩增, PCR产品定量和鉴定,混合和纯化PCR产物,使用无链®DNA PCR样品制备法生成测序文库,测序结果最终进行生物信息分析㊂测序完成后,对测序得到的原始数据进行处理,随后基于有效数据进行OTUs聚类㊂根据OTUs 聚类结果,先做物种注释,接着进行Beta多样性分析,比较样本群落组成的相似性或差异性㊂粪便基因测序以及生物信息分析流程由北京博奥晶典生物技术有限公司提供,根据公司平台生成的数据和图片进行统计分析处理㊂1.9 统计学处理内脏敏感性检测结果采用SPSS23.0统计软件进行数据分析,实验所得结果为计量资料,经检验符合正态分布且方差齐,数据用均数±标准差(x±s)表述,多组比较采用单因素方差分析,采用LSD⁃t检验进行两两比较㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 内脏敏感性检测结果由表1可以看出,与空白组相比,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P<0.05),提示造模成功㊂经过电针治疗后,与模型组相比,在20mmHg的压力下,电针组腹壁回撤反射评分明显降低(P<0.05),而在更大压力下的变化并不明显,说明电针可以有效改善IBS⁃D大鼠的内脏敏感性,对于更大压力变化不明显的原因有待进一步探索㊂2.2 OTU分类韦恩图通过三组样本的OTU分布,对样本的物种分布情况初步判断,如图1所示,空白组OTU个数共有2106,模型组共有1739个,电针组共有2047个OTU 数目;其中模型组与空白组相交叠的OTU数目明显低于电针组与空白组交叠数目㊂说明经过治疗后,电针组总OTU数目以及与空白组交叠数目均有所上升㊂表1 三组大鼠电针后不同压力下腹壁回撤反射评分结果(x±s)组别鼠只20mmHg40mmHg60mmHg80mmHg 空白组80.6675±0.0895 1.9988±0.1257 2.8338±0.0892 3.6675±0.0893模型组8 2.0000±0.0000a 3.0825±0.0540a 3.8750±0.0879a 4.0000±0.0000b电针组9 1.7411±0.2787ab 3.0756±0.1216a 3.8156±0.1125a 4.0000±0.0000b 注:与空白组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5849注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图1 三组大鼠OTU 分类韦恩图2.3 大鼠粪便菌群测序量分析Shannon 稀释曲线可以用来反应各样本在不同测序数量时的微生物多样性,如图2所示,各组大鼠OTUs 不会随着测序量增加而上升,曲线趋于平坦,说明可以反应该样本绝大多数微生物多样性信息,足够可靠㊂图2 三组大鼠粪便菌群测序量分析Shannon⁃Wiener 图2.4 大鼠粪便菌群物种组成分析根据OTU 聚类结果,分别在纲㊁属㊁种水平上发现,三组的肠道菌群群落结构基本相似,只是构成比有差异㊂通过比较三组大鼠的菌群物种分布情况,说明电针治疗可以改善菌群结构㊂在纲(class)水平上,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁芽孢杆菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲四种菌纲丰度相对较高㊂与空白组相比,模型组拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲等均有升高,芽孢杆菌纲则明显降低㊂而电针组的菌群结构则在模型组的基础上有所变化㊂如图3A 所示㊂在属(genus)水平上,三组中排在前六位的菌属主要有乳杆菌属㊁lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌属)㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Eubacterium _coprostanoligenes_group(真杆菌属)㊁Ruminiclostridium_9㊁Ruminococcaceae_UCG.014等㊂与空白组相比,模型组乳杆菌属㊁真杆菌属明显降低,毛螺菌属㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Ruminiclostridium_9㊁Rumi⁃nococcaceae_UCG.014(瘤胃菌属)等明显升高㊂经过电针治疗后,可看出以上菌属丰度均有一定的改善㊂如图3B 所示㊂在种(species)水平上,模型组的菌种结构分布与空白组存在明显差异,其中约氏乳杆菌的占比明显减少,而隶属于灰色部分的其他菌种的占比明显增加,经过电针治疗后有所改善㊂如图3C 所示㊂2.5 大鼠粪便菌群多样性比较Beta 多样性分析用来比较不同样本在物种多样性方面的相似程度㊂采用bray curtis 的算法计算样本间的距离,得到主坐标(PCoA)分析的结果,从图4可看出模型组与空白组明显被区分开(P <0.05),电针组则在两组之间;且模型组㊁空白组的组内集群效果好,电针组较差㊂说明了电针组样本在向空白组靠近,电针可以改善IBS⁃D 大鼠模型的Beta 多样性㊂3 讨论依照自然属性分类,人体常见的几大细菌门主要为拟杆菌门㊁厚壁菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等,大多数人肠道菌群中百分之九十九由这四种菌门组成,它们的丰度和构成比例对人们的健康影响极大[10]㊂有研究表明IBS⁃D 患者肠道菌群结构与健康人相比存在失调情况[11⁃12],其肠道微生物在粪菌移植治疗后,会出现菌群丰度增加㊁结构改变的情况[13]㊂近几年,很多学者将肠道菌群作为治疗IBS⁃D 的靶点,得到了较好的效果㊂IBS⁃D 患者的肠道微生物失调总结起来就是有害菌增加㊁有益菌减少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌减少是非常有必要的㊂目前,大多研究都认为,厚壁菌纲㊁拟杆菌门等丰度增加,乳杆菌属㊁双歧杆菌等丰度降低会引起IBS⁃D [15⁃17]㊂众所周知,IBS⁃D 患者的典型症状主要是腹痛㊁腹泻㊁腹胀等,这与内脏高敏感性相关[18],曾有学者提出其腹痛症状与肠道菌群结构关系密切,在于肠道菌群会产生能加重腹痛症状的乙酸盐[19];同时,也有人指出腹泻症状与某些菌群密切相关,可能是因为一些肠道850 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5 注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图3 三组大鼠菌群物种分布比较图4 基于bray curites 距离的PCoA 分析菌群能够产生影响肠道渗透性的脂多糖[20]㊂因此,通过改善肠道菌群结构紊乱的情况,可以缓解IBS⁃D 的症状㊂本实验通过慢性束缚应激联合番泻叶灌服法构建IBS⁃D 大鼠模型,实验结果证明电针足三里可以通过改善大鼠肠道菌群结构达到治疗大鼠的目的㊂通过分析各组大鼠粪便菌群在不同水平上的物种组成的结果发现,IBS⁃D 大鼠粪便菌群的物种构成与空白组大鼠存在明显差异,这与其他人的研究结果一致[21⁃22]㊂本研究发现,乳杆菌属明显降低,且其中约氏乳杆菌种下降非常明显,乳杆菌属做为有益菌,可以对抗机体致病微生物,改善肠道屏障功能,预防和治疗腹泻㊂此外,本研究还发现模型组的普雷沃氏菌Ga6A1属丰度明显高于其他两组,Prevotellaceae_Ga6A1_group 隶属于普氏菌属,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物发酵,诱发内脏超环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5851敏反应,甚至可能通过增加肠道通透性的方式加剧腹痛腹泻的症状㊂基于此,普雷沃氏菌的增加与内脏高敏感性呈正相关㊂因此,乳杆菌属的降低㊁普雷沃氏菌的增加都可能是IBS⁃D的起病原因㊂本实验通过电针足三里穴发现,IBS⁃D大鼠具有内脏高敏的反应,且证实了其具体的内在机制可能与肠道菌群结构有关;明显可以看出模型组相较空白组而言有降低或增加的肠道微生物,在电针组中或多或少得到了改善㊂本研究证明了高通量测序技术可以满足大鼠肠道菌群的检测需求,为深入研究电针足三里穴治疗IBS⁃D提供了参考思路,但由于受客观条件的影响,并未对实验中改变明显的菌群进行功能预测,未来可进一步研究菌群的功能基因在代谢途径和蛋白功能上的差异和变化㊂参考文献[1] 王菲,高斌.腹泻型肠易激综合征患者的肠道微生态特征[J].临床合理用药杂志,2021,14(8):157⁃158. 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基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌
基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌
基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌
目的:探讨EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂(DVS)未知乳杆菌的分子生物学鉴定方法.方法:采用显微观察初步鉴定,利用16SrDNA序列分析方法进一步鉴定,利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对,构建系统发育树进行分析,并对菌种进行特异PCR分析.结果:最终确定该未知乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus).结论:基于16SrDNA序列分析及特异PCR结合的方法可以快速、准确地的鉴定出未知乳杆菌.
作者：彭亚会高学军刘营PENG Ya-hui GAO Xue-jun LIU Ying 作者单位：彭亚会,PENG Ya-hui(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030;哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,哈尔滨,150086)
高学军,刘营,GAO Xue-jun,LIU Ying(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030)
刊名：生物技术 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2008 18(3) 分类号：Q93-331 关键词：EZAL-MY96 乳杆菌 16SrDNA 特异PCR 鉴定。
16SrDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性
16S rDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性*许颖1,2**马德胜1,2宋文枫1,2魏小芳1,21中国石油勘探开发研究院北京1000832提高石油采收率国家重点实验室北京100083摘要本研究以16S rDNA为分子标记，通过高通量测序技术对三口采油井的油藏微生物多样性进行了全面和深入的分析。
对三个DNA样本中细菌16S rDNA的PCR扩增产物进行高通量测序，得到123,360条优化序列，测序深度指数超过99.9%。
根据序列相似性进行聚类分析，得到139个OTU。
基于OTU的物种分类分析发现三个样本中的细菌种类覆盖91个属、29个纲和20个门，其中包括多种采油有益菌。
分别对各个样本的菌种组成和相对丰度进行分析，发现不同采油井的主要菌种组成和优势类群呈现出差异性。
结果表明，16S rDNA高通量测序能更加全面、准确和深入地反映油藏微生物多样性情况，为微生物采油技术提供有用和必要的背景信息。
图6表1参27关键词油藏；微生物多样性；16S rDNA；高通量测序CLC TE357收稿日期Received: 接受日期Accepted:*中国石油天然气股份有限公司科技攻关专项（2014A-1006）Supported by CNPC Programs f or Science and Technology Development (2014A-1006).**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:*************************.cn)16S rDNA-assisted analysis of microbial diversity in oil reservoirs by NGS*XU Ying 1,2**, MA Desheng1,2, SONG Wenfeng1,2& WEI Xiaofang1,21PetroChina Research Institute of Petroleum Exploration & Development, Beijing 100083, China2State Key Laboratory of Enhanced Oil Recovery, Beijing 100083, ChinaAbstractObjectives:Indigenous microbial community in oil reservoirs has great influenceon the application ofmicrobial enhanced oil recovery technology (MEOR). This paper aims to obtain accurate information about microbial diversity in oil reservoirsby the aid of a recently developed next generation sequencing technology(NGS). In this study, NGSand application of 16S rDNA molecular marker were combined.Methods:Total DNA of three samples was extracted separately, followed by amplification of bacterial 16S rDNA fragment. PCR productswere sequenced on the Illumina Miseq platform.Sequencing datasetwith high quality was collected for further analysis. Identification of bacteria at different taxonomic levels was performed basedon the result of blast against annotated16S rDNA database. Microbial diversity ineach samplewas analyzed separately and comparison among them was alsoperformed.Results: 123,360 16S rDNA sequences with high quality were obtained and thesequencing coverage was more than 99.9%. These sequences were clustered into 139 OTUs. Bacterial species detected in these samples covered 91 genera, 29 classes and 20 phyla, including many groups beneficial for MEOR.Bacteria(e.g.,Arcobacter, Pseudomonas and Acinetobacter)that can utilize petroleum hydrocarbons as sole carbon sources were detected,eventhose with extremely low abundance.Moreover, the analysis of microbial community structure for each sample showeddifferentpatterns ofcomposition characteristicsand dominant groups.Conclusions:The results indicate that analysis basedon high-throughput sequencing data of 16S rDNA fragments is powerful in reflecting microbial community structure accurately and provides more information for MEOR compared to traditional methods.Keywords oil reservoirs; microbial diversity; 16S rDNA; high-throughput sequencing/ next generation sequencing (NGS)油藏环境是一种独特的生态环境，其中存在着丰富的微生物资源[1-3]。
16s rdna测序原理
16s rdna测序原理
16s rDNA测序原理是基于微生物的基因组学研究，它是
一种用于鉴定微生物物种的方法。
它以16s rDNA（核糖体rDNA）序列作为微生物鉴定的基础。
16s rDNA是一种普遍存
在于细菌和古菌核糖体中的核酸，具有一定的特殊序列，它们在不同物种之间有着显著的差异。
16s rDNA测序技术是一种利用这种序列息分析样本中微
生物组成的高通量分析技术。
它可以准确地检测到各种微生物，从而实现对样本中微生物的识别和定性分析。
细菌和古菌的16s rDNA测序可以从样品中提取16S
rDNA序列的基因序列，再利用PCR（聚合酶链反应）技术对16S rDNA序列进行扩增，然后再用测序仪对扩增的16S
rDNA序列进行测序，最后再利用计算机分析软件对测序结果
进行分析，从而得到样品中微生物的物种组成。
16s rDNA测序技术在微生物鉴定中非常重要，它是一种
快速、简便、高灵敏的方法，能够准确地识别出样品中的微生物，而不需要进行其他复杂的分析步骤，极大地提高了微生物鉴定的效率和准确性，可以用于环境监测、食品安全检测、医学检测等方面。
16s rDNA测序技术同时也可以用于微生物群落的多样性研究，可以检测样品中微生物种群的多样性，以及不同微生物之间的相互作用，为生态学研究提供重要的息。
总之，16s rDNA测序技术是一种灵敏、可靠、准确的微生物鉴定技术，它可以用于微生物的鉴定和多样性研究，为环境监测、食品安全检测、医学检测等方面提供重要的息，发挥着重要的作用。
奶牛乳房炎主要致病菌的分离鉴定及大肠杆菌噬菌体的生物学效应研究
奶牛乳房炎主要致病菌的分离鉴定及大肠杆菌噬菌体的生物学效应研究首先，研究人员收集了多个不同奶牛场的乳房炎样本。
样本的采集要求严格，以确保获取的样本是真正反映奶牛乳房炎症状的。
从不同样本中分离出的细菌会在特定培养基上进行进一步培养。
常用的培养基包括血琼脂、马都基琼脂等。
通过分离细菌的方式可以精确地确定致病菌的类型和数量。
在对分离出的细菌进行鉴定之前，研究人员利用不同的培养基和培养条件进行纯化。
纯化过程主要是将其他细菌和杂质与目标细菌分离，使得分离得到的细菌纯度更高。
常用的纯化方法有革兰氏染色、API试剂盒、PCR等。
通过纯化，研究人员可以获得清晰的细菌形态、生长特点和生理特性。
经过纯化后，研究人员对致病菌进行了进一步的分子鉴定。
目前，常用的分子鉴定方法主要包括16S rRNA测序技术、多重PCR技术等。
通过这些技术，研究人员可以准确鉴定奶牛乳房炎的致病菌。
在确定奶牛乳房炎主要致病菌的同时，研究人员也对大肠杆菌噬菌体的生物学效应进行了研究。
大肠杆菌噬菌体是一种寄生于大肠杆菌上的噬菌体，可以选择性地感染并杀灭大肠杆菌。
研究人员将大肠杆菌噬菌体与奶牛乳房炎患奶牛的分泌物进行接触实验，观察其对大肠杆菌的生物学效应。
实验结果显示，大肠杆菌噬菌体对大肠杆菌具有较高的选择性感染和杀灭能力。
在接触实验中，大肠杆菌噬菌体可以迅速繁殖并杀灭患奶牛分泌物中的大肠杆菌。
此外，大肠杆菌噬菌体还具有一定的溶菌能力，可以释放出一些有害细菌产生的毒素。
这些结果表明，大肠杆菌噬菌体在治疗奶牛乳房炎方面具有潜在的应用价值。
综上所述，奶牛乳房炎的致病菌鉴定是对该疾病研究的重要一步。
通过对致病菌的分离、纯化和分子鉴定，可以获得更多关于奶牛乳房炎病原菌的信息。
此外，大肠杆菌噬菌体对大肠杆菌的生物学效应研究为治疗奶牛乳房炎提供了新的思路和方法。
希望通过对奶牛乳房炎主要致病菌的深入研究，可以为奶牛养殖业的健康发展和生产提供更好的支持和保障通过6S rRNA测序技术和多重PCR技术，研究人员可以准确鉴定奶牛乳房炎的致病菌。
利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法 - 奶牛养殖
利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法-奶牛养殖奶牛乳腺炎是困扰奶牛业发展的四大疾病之首，是最常见、治疗花费最高的疾病之一，主要是由病原微生物在奶牛乳腺内感染引起的炎症反应。
据统计，我国每年因乳房炎造成的经济损失达135亿元。
可以引起奶牛乳房炎的微生物种类有很多，如细菌、病毒、真菌、支原体等，目前从患有乳房炎的奶牛乳汁中分离到了160多种微生物，以细菌感染比较多见，引发该疾病的致病菌主要有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这三种细菌引起的乳腺炎占总发病率的90%以上。
本研究中，通过对乳腺炎患牛乳汁的病原菌培养、分离及药敏试验后，得到乳腺炎致病菌株，通过对其16S rRNA基因的序列进行分析，为该株致病菌的研究提供参考。
1、材料与方法乳腺炎致病菌分离将乳腺炎患牛乳汁稀释后，分别接种到血琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，恒温培养，观察记录菌落形态、大小及溶血情况，接种到肉羊培养基中增菌培养。
分离菌株药敏试验将上述分离的致病菌分别接种到肉汤培养基培养，周围黏贴药敏片，培养24 h，观察抑菌直径。
细菌学鉴定及致病性确定采用生化与革兰氏染色镜检，确定耐药菌形态，并进行细菌学分类。
抽取分离培养后的菌液500 μL，腹腔注射健康小鼠，24 h后观察小鼠发病情况，如小鼠死亡则认定该菌株具有致病性。
细菌16S rRNA基因克隆与测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌液进行基因组DNA的提取，后利用细菌16S rRNA基因通用引物（F：5 7- AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG - 3&acute;; R:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行细菌16S rRNA基因PCR扩增（扩增体积为50lJL;条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃终延伸10 min，4℃结束反应），电泳以及胶回收后，连接pMD - 18T载体连接克隆，经过筛选后将有16S rRNA基因序列插入的质粒提取测序。
基于16S rRNA高通量测序技术分析安格斯牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究
基金项目：内蒙古自治区“草原英才工程”青年创新创业人才第一层次培养项目（Ｑ２０１７０２２）；内蒙古自治区自然基金面上项目 （２０１８ＭＳ０３０２２，２０１７ＭＳ０３４２）；内蒙古自治区自然基金项目（２０１８ＬＨ０３０１３）；内蒙古自治区科技创新引导项目（ＫＪＣＸ１７０３） 作者简介：吴琼 女，硕士研究生。
研究方向为动物营养与饲料科学。
Ｅ ｍａｉｌ：ｗｕｑｉｏｎｇ＿０４１２＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者。
王思珍，男，教授，硕士生导师。
研究方向为动物营养与饲料科学。
Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｓｉｚｈｅｎ＠ｉｍｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ 牛化欣，男，教授，硕士生导师。
研究方向为动物营养与生物饲料高效利用。
Ｅ ｍａｉｌ：ｎｉｕｈｘ＠ｉｍｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ 收稿日期：２０１９ １１ ０１基于１６ＳｒＲＮＡ高通量测序技术分析安格斯牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究吴 琼１，王思珍１ ，张 适１，尤 欢２，胡宗福１，牛化欣１（１．内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽 ０２８０００；２．通辽市家畜繁育指导站，内蒙古通辽 ０２８０００）摘 要 本研究旨在系统探索和分析安格斯牛瘤胃微生物多样性及其基因功能。
选用体重５５０ｋｇ左右的安格斯牛６头分成２组，利用基于１６ＳｒＲＮＡ高通量测序技术检测牛瘤胃液样本进行组学分析。
结果表明，２组样本通过ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｓｅｑ测序平台共获得８６２９８条高质量优质序列，聚类为３４６个操作分类单元（ＯＵＴ），经分类学鉴定分属１３个门，２１个纲，２４个目，４０个科，１２３个属。
拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）４３ １６％和厚壁菌门（Ｆｉｒ ｍｉｃｕｔｅｓ）３６．２９％为优势菌群。
基于属的组成，依次为普雷沃氏菌属＿７（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ＿７）２９．２８％、琥珀酸弧菌科＿ＵＣＧ ００１（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ＿ＵＣＧ ００１）１１．３０％、琥珀酸菌属（Ｓｕｃｃｉｎｉｃｌａｓｔｉｃｕｍ）１１．１０％、普雷沃氏菌属＿１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ＿１）６．６５％、瘤胃球菌属＿１（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿１）５．１７％、琥珀酸弧菌属（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ）２．７５％等。
16SrDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性
第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 国家质检总局科技计划项目(2011IK228)Fund: Supported by Science and Technology Planning Project of Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine(2011IK228) *通讯作者: 张建军, 高级工程师, 主要研究方向为微生物检测。
E-mail: jianjunn@*Corresponding author: ZHANG Jian-Jun, Senior Engineer, Technical Center of Shanxi Entry-Exit Inspetion and Quarantine Bureau, No.8 of Yifen Street, Taiyuan 030024, China. E-mail: jianjunn@16S rDNA 克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性张敏爱1, 张建军1*, 王子亮2, 苑 利1, 杨秀清3(1. 山西出入境检验检疫局技术中心, 太原 030024; 2. 中国合格评定国家认可中心, 北京 100062;3. 山西大学生物技术研究所, 太原 030006)摘 要: 目的 利用16S rDNA 基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。
方法 提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA 为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA 的PCR 产物与pMD~18T 载体连接, 构建其菌群的16S rDNA 文库。
对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST 比对。
结果 文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。
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基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋【摘要】本试验旨在利用16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响.选择泌乳阶段相近、胎次相同的泌乳早期奶牛4头,随机分为2组,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮,同时添加60 g/头甘露寡糖,通过口腔灌注添加.采用2×2交叉试验设计,每期21 d,预试期14 d,采样期7 d.结果表明:1)与对照组相比,添加甘露寡糖极显著提高了瘤胃液乙酸的浓度(P<0.01),乙酸/丙酸提高了8.47％(P>0.05).2)与对照组相比,门水平上,试验组蓝藻门相对丰度极显著降低(P<0.01),装甲菌门的相对丰度极显著提高(P<0.01);属水平上,试验组厌氧螺菌属的相对丰度显著提高(P<0.05),梭菌属的相对丰度显著降低(P<0.05),锥形杆菌属的相对丰度极显著降低(P<0.01),瘤胃球菌属、假丁酸弧菌属以及毛螺菌属的相对丰度分别增加24.34％、12.83％、31.80％(P>0.05),普雷沃氏菌属的相对丰度降低4.66％(P>0.05),未注释韦荣氏菌属的相对丰度提高143.11％(P>0.05),脱硫弧菌属的相对丰度提高4.88％(P>0.05).在本试验条件下,添加甘露寡糖降低了瘤胃细菌的多样性,对纤维素降解菌群、半纤维素降解菌群影响明显,显著提高了瘤胃液乙酸浓度,提高了瘤胃液pH,但差异不显著.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)010【总页数】11页(P4048-4058)【关键词】奶牛;瘤胃;甘露寡糖;16SrDNA;菌群【作者】郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋【作者单位】宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川750021【正文语种】中文【中图分类】S816功能性寡糖具有调控动物胃肠道微生物生长和改变微生物区系组成的作用，甘露寡糖是功能性寡糖的一种。
研究发现甘露寡糖能够改善单胃动物肠道菌群结构，促进有益菌群增殖[1-2]，增强免疫力[3]，提高动物生产性能[4]。
在犊牛饲粮中添加的甘露寡糖在通过小肠时，与侵入病原菌的碳水化合物基团结合，使病原菌既不能繁殖，又不能附着在犊牛的肠壁，被安全排出体外，而对乳酸菌等有益菌没有负面影响[5]。
近几年研究人员在成年反刍动物上也进行了甘露寡糖应用研究，发现其在促进瘤胃发酵、瘤胃菌群结构等方面也具有积极作用。
Heinrichs等[6]报道，甘露寡糖能够优化牛的胃肠道微生态环境，促进双歧杆菌等有益菌的增殖，抑制大肠杆菌等致病菌的增殖。
刘立恒等[7]研究报道，饲粮添加甘露寡糖与其他寡糖组合后，牛瘤胃液细菌的PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)图谱条带数明显增加，经测序，其中2个是产琥珀酸丝状杆菌属。
甘露寡糖作为主要功能性寡糖在单胃动物上研究较多，目前在反刍动物上的应用研究也备受关注，但甘露寡糖如何改变瘤胃菌群结构目前报道不一。
为此，本研究基于16S rDNA高通量测序分析技术，探讨添加甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构与多样性的影响，为其在奶牛中的应用研究提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料甘露寡糖购买于河南三化生物科技公司，纯度为99%。
1.2 试验动物与饲粮选择4头泌乳天数为20 d、日产奶量30 kg左右、体重为550 kg左右的经产(二胎)中国荷斯坦泌乳奶牛作为试验动物。
根据NRC(2001)奶牛饲养标准配制饲粮，精粗比为40∶60(DM基础)，基础饲粮组成及营养水平见表1。
试验动物采用全混合日粮(TMR)饲喂方式，日投料3次，自由采食。
全天自由饮水。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %项目 Items含量 Content原料Ingredients苜蓿干草 Alfalfa licorice21.53羊草 Leymus chinensis3.14玉米青贮 Corn silage27.65玉米 Corn24.47豆粕 Soybean meal14.68麦麸 Wheat bran1.48全棉籽 Whole cottonseed4.20预混料 Premix1)0.91磷酸氢钙CaHPO4 0.91食盐 NaCl 0.80氧化镁 MgCl20.23合计 Total100.00营养水平Nutrient levels2)粗蛋白质 CP 17.35产奶净能 NEL/(MJ/kg)7.23中性洗涤纤维NDF 31.25酸性洗涤纤维 ADF22.63钙 Ca 0.84磷 P0.401)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 14 000 IU，VD3 7 500 IU，VE 43 mg，Se 0.6 mg，Cu 30 mg，Fe 358 mg，Mn 260 mg，盐霉素钠 salinomycin sodium salt 20 mg，杆菌肽锌zinc bacitracin 100 mg，硫酸杆菌 sulfuric acid bacillus 39 mg。
2)产奶净能为计算值[8]，其他为实测值。
NEL was a calculated value[8], while the others were measured values.1.3 试验设计将试验牛随机分为2组，对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮，同时添加60 g/头甘露寡糖(参照刘立恒等[7])，通过口腔灌注添加。
采用2×2交叉试验设计，每期21 d，其中预试期14 d，采样期7 d。
1.4 样品采集与处理1.4.1 瘤胃液采集通过牛口腔导管采集瘤胃液，准备牛鼻夹把牛头固定，在口腔中放入硬管(硬塑胶，内径要超过取样软管)，插入深度不要超过咽部，外面露出20 cm左右，工作人员能够用手把其固定，然后把软管(2.5 m左右)通过口腔硬管内径逐步送入瘤胃，将牛头压低，通过牛的咀嚼过程使瘤胃液自然流出。
1.4.2 瘤胃液的处理将采集的瘤胃液转移至实验室内，用4层纱布过滤，将过滤后的瘤胃液等量混匀。
pH直接用比色计测定；取20 mL瘤胃液于50 mL离心管中，然后将部分转移至含有3 mL 25%偏磷酸和0.6% 2-乙基丁酸的10 mL离心管，于-20 °C的冰箱内保存，用于挥发性脂肪酸浓度的测定。
挥发性脂肪酸浓度采用气相色谱法[9](Agilent-6890N气相色谱仪)测定；另取50 mL瘤胃液于离心管中，放置于-80 ℃冰箱冻存，用于菌群结构分析，共有8个样品，其中添加甘露寡糖的试验组4个样品(MT-1、MT-2、MT-3、MT-4)，没有添加甘露寡糖的对照组4个样品(CK-1、CK-2、CK-3、CK-4)。
1.5 DNA样品提取、扩增1.5.1 DNA提取DNA采用试剂盒提取，试剂盒采购于南京建成生物工程研究所，提取步骤参照试剂盒中的说明书操作。
1.5.2 PCR扩增PCR扩增前用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度和浓度，于离心管中取适量的样品进行稀释。
将稀释后的基因组DNA作为模板。
瘤胃液DNA扩增目的片段为V3+V4区，大概长度468 bp，V3+V4区引物为341F-806R[10]，引物序列为341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。
1.6 PCR产物的混样和纯化PCR产物使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；依照PCR产物浓度的检测结果进行等浓度混样，充分混匀后使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，使用南京建成生物工程研究所提供的回收试剂盒回收产物。
1.7 Miseq测序将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Miseq测序，测序采用Miseq 2500 PE 250平台。
1.8 数据统计分析数据采用Excel 2007进行初步处理，采用SAS 8.2统计软件中的两阶段交叉设计资料的方差分析进行数据处理。
P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析2.1 甘露寡糖对奶牛瘤胃发酵参数的影响由表2可以看出，试验组奶牛瘤胃液pH与对照组相比提高了2.46%(P>0.05)。
与对照组相比，添加甘露寡糖极显著提高了瘤胃液乙酸的浓度(P<0.01)，乙酸/丙酸提高了8.47%(P>0.05)。
表2 甘露寡糖对奶牛瘤胃发酵参数的影响Table 2 Effects of mannan oligosaccharides on fermentation parameters in the rumen of dairy cows 项目 Items对照组 Control group试验组 Experimental groupSEMP值 P-valuepH6.927.090.010.08乙酸 Acetic acid/(mmol/L)54.60B64.28A3.68<0.01丙酸 Propionic acid/(mmol/L)22.1623.932.080.37丁酸 Butyrateacid/(mmol/L)18.1720.831.320.05乙酸/丙酸 Acetic acid/propionicacid2.482.690.050.30同行数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
下表同。
In the same row, values with no letter superscript mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.2.2 16S rDNA基因V3+V4区域扩增结果对照组和试验组每组取4个样，共取8个瘤胃液样品。