第九章 蛋白质相互作用与定量蛋白质组学
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学是生物科学中重要的研究领域，它们帮助我们更深入地了解蛋白质在生物体内的功能和调控机制。
在这篇文章中，我们将介绍这两个领域的基本概念、研究方法和应用。
定量蛋白质组学是研究蛋白质组中蛋白质的表达水平和相对丰度的方法。
通过比较不同条件下蛋白质的表达差异，我们可以了解到蛋白质在生物体内的功能和调控机制。
定量蛋白质组学通常使用质谱技术，如液相色谱质谱法（LC-MS/MS），来对蛋白质进行定量分析。
这项技术可以同时鉴定和定量成千上万种蛋白质，从而提供全面的蛋白质组信息。
靶向蛋白质组学是研究特定蛋白质或蛋白质家族的表达、结构和功能的方法。
与定量蛋白质组学相比，靶向蛋白质组学更加注重深入研究某些特定蛋白质在生物体内的作用机制。
靶向蛋白质组学通常使用特定的抗体或亲和剂来选择性地富集和检测目标蛋白质。
这种方法可以帮助我们了解特定蛋白质的功能、调控和相互作用网络。
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学在许多生物学研究领域中都有广泛的应用。
比如，它们可以用于研究疾病的发生机制和诊断标志物的发现。
通过比较疾病组织和正常组织中的蛋白质表达差异，我们可以找到与疾病相关的蛋白质，并开发相应的治疗方法。
此外，定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学还可以应用于药物研发和药物靶点的鉴定。
通过研究药物与特定蛋白质的相互作用，我们可以更好地理解药物的作用机制和效果。
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学是生物科学中重要的研究领域，它们帮助我们深入了解蛋白质的功能和调控机制。
通过定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学的研究，我们可以揭示生物体内复杂的蛋白质相互作用网络，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
这些研究为我们更好地认识生命的奥秘提供了重要的工具和手段。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学定量分析
蛋白质组学定量分析首先给出蛋白质组学的定义：研究各种蛋白质在生命过程中功能与相互作用规律的分子生物学技术，是近年来发展迅速的生物化学新领域。
蛋白质组学（ pro）是从蛋白质组或蛋白质组相关数据库提取、处理、组装和解析蛋白质组信息的技术。
最终通过相关数据库解析蛋白质组相关知识的蛋白质组学知识体系和结构模式的过程。
蛋白质组学基于生物信息学（ bioinformatics）的基本原理和方法，充分利用生物大数据库对蛋白质组进行准确和可靠的定量研究。
为什么要定量分析呢？我们知道生命过程的基本单位是细胞，而细胞是由不同的组成部分构成，这些不同组成部分叫做“组分”。
细胞内的“组分”在合适的条件下会有一些生命活动，如吸收营养、产生能量、控制物质运输等，就好像人类说话吃饭走路一样，不同的“组分”对应了不同的工作；但是没有这个“组分”也就没有任何工作，人的肌肉组织无法收缩。
因此细胞是生命的基本单位，蛋白质是生命活动的基本材料，蛋白质的生命活动决定细胞生命活动的基本特性，即功能特性。
所以，蛋白质的功能是通过与细胞膜上特定组分结合实现的。
在正常情况下蛋白质与“组分”的结合是随机的，当外界条件改变时，蛋白质与“组分”的结合就会出现异常。
比如缺少某个“组分”或“组分”突然失去活性，就会引起疾病，甚至导致死亡，因此蛋白质是细胞正常功能的重要保证。
那么，蛋白质组学定量分析能帮助我们解决哪些问题呢？ 1。
了解蛋白质组的基本状况，为药物设计提供参考。
2。
探索蛋白质组多样性的分布规律及影响因素。
3。
挖掘蛋白质组学与代谢组学间的联系。
4。
阐明蛋白质组学研究中存在的局限性及未来发展方向。
蛋白质组学定量分析主要是针对蛋白质定量分析，这里就包含三个方面：一是蛋白质组总体上的蛋白质定量分析；二是蛋白质组层次上的蛋白质定量分析；三是在具体研究中的蛋白质定量分析。
下面具体讲一下前两者：第一是蛋白质组总体上的蛋白质定量分析，主要指的是将一个具体的蛋白质组中的所有蛋白质都检测出来，再把这些蛋白质的序列进行分析，以获得更详细的信息。
相互作用蛋白质组学ppt课件
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应的抗原成分。 ⑵间接法：检测未知抗原时先用特异性抗体与相应抗原结合，洗去未结合
的抗体，再用荧光素标记的间接抗体与特异性抗体相结合，形成抗原特异性抗体-间接荧光抗体的复合物。 ⑶补体法：用特异性抗体和补体的混合物与标本上的抗原反应，补体就结 合在抗原-抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与补体结合，从而形 成抗原-抗体-抗补体荧光抗体复合物。 • 在研究蛋白质与蛋白质相互作用的实验中，最常用的免疫荧光技术是间 接法。抗原即是所要研究的靶蛋白。
质谱分析蛋白质的相互作用
蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。
其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。
研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。
因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。
近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。
酵母双杂交技术Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。
该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。
酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。
免疫共沉淀技术免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
蛋白质和蛋白质组学
蛋白质和蛋白质组学
蛋白质是生物体内非常重要的有机分子，它们是由氨基酸的多肽链组成的。
蛋白质在生物体内扮演着多种重要的角色，包括结构支持、催化反应、信号传递、调节基因表达和免疫响应等。
蛋白质的种类非常多样，每种蛋白质都有特定的结构和功能。
蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的系统性研究领域。
它主要关注蛋白质在生物体内的表达、结构和功能特征，并通过高通量技术来分析和解析蛋白质组的全貌。
蛋白质组学的目标是全面了解生物体内蛋白质的组成、相互作用和调控机制，以及蛋白质与疾病发生发展之间的关系。
蛋白质组学研究中常用的技术包括质谱分析和蛋白质芯片技术。
质谱分析是一种高灵敏度的分析方法，它可以对蛋白质样品进行定性和定量分析。
质谱分析通过将蛋白质样品分离、离子化和检测来确定蛋白质的质量和序列信息。
蛋白质芯片技术是基于DNA芯片技术的延伸，它可以用于高通量检测蛋白质的表达水平、蛋白质结构和相互作用等信息。
蛋白质组学的应用非常广泛。
在生物医学领域，蛋白质组学可以用于研究疾病的发生机制和诊断标志物的筛选。
通过比较健康人群和患病人群的蛋白质组差异，可以发现与疾病相关的蛋白质变化，从而为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
此外，蛋白质组学还可以用于药物研发和药效评价等领域。
总结起来，蛋白质是生物体内重要的有机分子，蛋白质组学是研究蛋白质的系统性研究领域。
蛋白质组学利用高通量技术来分析和解析蛋白质组的全貌，以深入了解蛋白质的表达、结构和功能特征。
蛋白质组学的应用广泛，可以用于疾病的研究和诊断，以及药物研发和评价等领域。
蛋白质组学原理
蛋白质组学原理
蛋白质组学是一门研究生物体内蛋白质组成、结构和功能的学科，是生物信息学领域的重要分支之一。
蛋白质作为生物体内最基本的功能分子，承担着细胞的结构支持、代谢调节、信号传导等重要功能，因此蛋白质组学的研究对于理解生命活动的机理、疾病的发生发展以及药物研发具有重要意义。
蛋白质组学的研究内容主要包括蛋白质的鉴定、定量、功能分析和相互作用等方面。
其中，蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究的基础和关键，通常采用质谱技术进行蛋白质的鉴定。
质谱技术是利用质谱仪对蛋白质进行分析，通过蛋白质的质量/电荷比、氨基酸序列等信息来确定蛋白质的身份。
在蛋白质的定量方面，常用的方法包括同位素标记法、定量质谱法等，这些方法能够准确地测定蛋白质在不同生理状态下的表达水平。
在蛋白质功能分析方面，蛋白质组学常常结合蛋白质结构生物学、蛋白质相互作用等技术手段，对蛋白质的功能进行研究。
蛋白质组学还可以通过分析蛋白质的修饰情况、亚细胞定位等信息来揭示蛋白质的功能特性。
此外，蛋白质组学还可以通过研究蛋白质的相互作用网络，揭示蛋白质在细胞内的相互作用关系，从而理解细胞内生物过程的调控机制。
总的来说，蛋白质组学的研究对于推动生命科学的发展具有重要意义。
随着蛋白质组学技术的不断进步，我们对于蛋白质组的认识也将更加深入，这将有助于揭示生命活动的奥秘，促进疾病的诊断和治疗，推动新药的研发，对于人类健康和生命科学的发展都具有重要的意义。
希望通过蛋白质组学的研究，能够更好地理解生命的奥秘，为人类健康和疾病治疗提供更多的帮助。
蛋白质组学和定量蛋白质组学
百泰派克生物科技
蛋白质组学和定量蛋白质组学
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，从整体水平上分析一个有机体、细胞或者组织的蛋白质组成及其活动规律的科学，其研究的主要内容包括蛋白质表达鉴定、翻译后修饰形式鉴定、结构与功能分析、蛋白质定位、蛋白质差异表达以及蛋白质间的相互作用分析等方面。
定量蛋白质组学就是对一个混合体系中的全部蛋白质组分进行精确的含量鉴定，是蛋白质组学研究的一个重要分支。
定量蛋白质组学这一概念的提出标志着蛋白质组学研究已经从对蛋白质进行简单定性向精确定量方向发展。
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单杂交系统，one hybrid system DNA和蛋白质间相互作用。 鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。
三杂交系统，three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用 三者共同作用，才能激活转录。
三、酵母双杂交技术在蛋白质组 学中的应用
Interactome 互作组：全面详尽的 蛋白质相互作用图谱。 病毒、细菌、酵母、线虫等。 T7噬菌体：首先用于大规模Y2H分析：
蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面
Yeast Two Hybrid Mass Spectrometry
二、酵母双杂交技术及进展
Yeast Two-Hybrid，Y2H.
Fields S. and Song O.: Nature, 1989, 340: 245-246
研究蛋白质相互作用的方法,利用转 录因子组件式（modular）结构的性 质。Y2H 就是将需要研究的蛋白质设 计成“诱饵”，以钓出能与诱饵蛋白 发生物理相互作用的蛋白质（被捕食 蛋白质）。
Yeast
Organism Technology Protein arrays Pools of prey Number of assays (bait×prey) 192 ×proteome proteome ×proteome Detected interaction s 281 692 Alread y known 109 S.cerevisiae (~6000ORFs)
10 ×proteome 22 fragments ×proteome
Random × Random
• McCraith S.,et al. Genome-wide analysis of vaccinia virus proteinprotein interactions. Proc.Natl. Acad.Sci. 97,4879-4884 (2000) • Flajolet M.,et al. A genomic approach of the hepatitis C virus generates a protein interaction map.Gene 242,369-379 (2000) • Bartel P.,et al.A protein linkage map of Escherichia coli bacteriophage T7. Nature Genetics 12,72-77(1996)
Technology
Protein array
Number of assays (bait×prey) proteome ×proteome
Detected Already interactions known 37 0 5 25 9 2 2 4
Protein array HCV(10ORFs) Library screening T7 Library screening
噬菌体展示技术（Phage display）
· · · ·
Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit Ph.D. Peptide Display Cloning System
其他新的双杂交系统： 分离的泛素系统 split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344) 利用泛素的功能特点。 当分别与泛素N端和C端部分融合的两 个蛋白质相互作用时，使分离的泛素的 两部分靠近，泛素专一性的蛋白酶就会 识别泛素，导致报道蛋白的解离释放。
430 assays of pools 96×96
3844 assays of pools 96×96 15×proteome 11 ×proteome 68×proteome
175
12
841 170 113 191
105 3 34 128
Viral genome
Organism
Vaccinia vrius (~266ORFs)
诱饵基因的扩增和表达载体的构建 诱饵表达载体转化到酵母库扩增,质粒提取 诱饵和猎物用共转化或交配(Mating)的方法转化 到同一酵母中 涂布到约50个筛选平板上 菌落长出后，挑取阳性菌落作beta-gal报道基因 实验 菌落PCR扩增猎物基因，测序 Blast分析得到猎物基因序列 阳性相互作用的重新验证(Co-IP,pull-down,共定 位等功能实验）
七、酵母双杂交技术方法
首先是选择适当的载体系统： BD, AD 载体：Gal4,LexA系统，多 已商业化。然后将待鉴不同结合型（a,α）的 表达“猎物”和“诱饵”蛋白的酵母菌 株一一结 未知蛋白。
Y2H开始以转录因子Gal4为基础，依靠 招募RNA聚合酶II激活转录。 1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III 为基础的Y2H，假阳性率更低。
反向双杂交系统：reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因（URA3， U合成所必需），蛋白质互作激活报告基因 表达，使细胞不能成活。
四、噬菌体展示技术 （Phage display）
噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的 蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒 的外部，在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛 选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、 细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单， 将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌 体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗 粒将被洗掉，再将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养， 再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体 颗粒。
55个有25个相互作用。 丙型肝炎病毒HCV：编码10个成熟蛋白， 有5个相互作用。
酿酒酵母：6000多个ORF, 1996完成 基因组,P. et al., Nature, 2000,403:623-627.
线虫：148个相互作用： Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.
一个单转录因子有：
DBD: DNA binding domain DNA结合结构域。 AD:Activation domain, 转录激活结构域：能激活RNA聚合 酶起始转录。
诱饵蛋白B + DBD:不能起始转录
被捕食蛋白的ORF + AD:不能起始转录。
当诱饵蛋白和被捕食蛋白在同一细胞中 表达，如发生相互作用， RNA聚合酶将 启动报告基因His3转录，合成组氨酸， 如His3不表达，细胞不能生长。
Caenorhabditis elegans 线虫
Organism C.elegans(~ 20000ORFs) Technology Protein array Library screeing Number of assays (bait×prey) 29×29 27 ×proteome Detected interactions 8 124 Already known 6 3
八、双杂交系统及其应用
主要商业公司：
APPLIED BIOSYSTEMS BIOSIGNAL PACKARD INC.
CLONTECH
INVITROGEN ORIGENE TECHNOLOGIES INC.
PROMEGA CORP
QBIOGENE STRATAGENE
Clontech 公司的酵母双杂交系统
特点：
快速、安全，不需标记物和染料， 还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相 互作用。 SPR DNA生物传感器可用于基因 突变的检测、PCR产物测定、病毒检 测等。
六、蛋白质间连锁图的建立
已建立酿酒酵母1548个蛋白质间 2358个相互作用网络: Fields, S. Lab: Nat. Biotechnology 2000,18:1257-1261.
Fields S. and Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340: 245-246
优点：
酵母细胞几乎能表达所有生物基因。
缺点： 并非所有蛋白质能在酵母核内正常 行使功能，不正确的蛋白质折叠结构： 假阳性 假阴性
S.cerevisiae Pools of baits and prey (~6000ORFs) S.cerevisiae Pools of baits and prey (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs)
五、表面等离子体共振技术 SPR Surface Plasmon Resonance 研究蛋白质相互作用的新方法。如 瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。 将诱饵蛋白作为配基，固化在几十 纳迷厚的金属膜表面，加入含猎物蛋 白的溶液，如有相互作用会特异性结 合形成蛋白质复合物，使金属膜与溶 液界面的折射率上升，导致共振角度 改变。
分离杂交系统，split-hybrid system 利用2个相互整合的报告基因。
细胞质中的双杂交系统： SOS招募系统： SOS recruitment system 利用Ras信号传导途径的基本性质： 两种蛋白相互作用，就会将hSos (人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上，激活 Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和 增殖。