动物细胞工程实验室简介
细胞工程 第一章 细胞工程简介
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• 1998年2月，英国宣布克隆出牛犊“杰弗逊”； • 1998年7月，日籍科学家成功地得到3代克隆小鼠，这 是首次用克隆动物克隆出动物； • 2001年1月，美国克隆恒河猴成功，命名为“泰特 拉”，这意味着克隆人不存在技术障碍； • 2002年3月，美国科学家克隆成功猫； • 2005年4月，韩国克隆出狗“首努比”(Snuppy)， 2008年9月4日通过双亲克隆狗生产狗宝宝，证明克隆 狗有繁殖能力。”
生物技术相关的行业涵盖了许多行业。
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Cell engineering
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Cell e指应用细胞生物学和分子生物学的方法，
通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平
或细胞器水平上，按人们的意愿来改变细胞
内的遗传物质并使之增殖，以获得新型生物
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细胞工程是一个非常年轻富有活力的 学科。在它诞生的100多年时间里，细胞 工程技术已经成为世界经济中最具活力的 支柱性产业，产生了巨大的经济效益和社 会影响。随着生命科学的不断深入，细胞 工程技术会得到更快的发展，在解决人类 的资源与环境等重大问题上大要作为。
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，
洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外 灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素
细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，
CO2培养箱，磁力搅拌器，培养基，血清
动物细胞工程基础实验
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配制液体培养基
1. 将培养基干粉（PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加 800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈 橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量 瓶，用三蒸水定容至刻度。
9. 接种细胞：吸取4 mL上述的细胞悬液，加入原细胞 培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4 mL；
10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、 代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培 养；
11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进 行第2代的传代。
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EPC细胞（消化前）
2. PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高 压灭菌备用；
3. 将PBS分装入试剂瓶中，瓶盖转松，牛皮纸包紧，橡皮 筋加固，装入提篮，121℃，20min灭菌；
4. 自然干燥冷却后，4℃保存备用。
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配制胰蛋白酶（0.25%）
1. 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制 的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
3. 胰蛋白酶（Trypsin）可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消 化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
4. EDTA溶液 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离 子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
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浅析动物细胞工程及其在制药工业中的应用
China Science & Technology Overview /学术研究浅析动物细胞工程及其在制药工业中的应用沈睿韬(江苏省苏州中学，江苏苏州215007)摘要：近年来，生物技术的发展十分迅速。
我们可以在体外对动植物细胞进行培养，从而生产特定的生物制品或测试新药的疗 效。
作为生物制药工业中的关键技术，细胞工程在农业、畜牧业及制药工业中都有着十分广泛的应用。
优良品种选育、家畜繁殖、药 物生产，都离不开细胞融合、核移植等技术。
细胞工程的飞速发展，使生物制药进入一个全新的时代。
本文对动物细胞工程的研究现 状进行了简要介绍，并分析了其在医药领域中的应用，以期为相关人员提供参考。
关键词：动物细胞工程；细胞融合；抗体偶联药物；生物制药中图分类号：Q2 文献标识码：A0. 引言作为现代生物技术的重要领域之一，细胞工程的发展 十分迅速，并带动了许多行业的发展。
通过基因工程、细 胞融合等技术，我们可以对动物或植物细胞进行改造，从 而获得所需的产品。
细胞工程在农业、食品工业、医疗领 域都有着广泛的应用。
在生物制药领域，细胞工程更是扮 演着重要的角色。
我们可以利用细胞工程，实现大规模的 细胞改造，以得到所需物质，或者合成一些不存在于自然界的 化合物。
在一些情况下，利用细胞工程，我们虽然不能直 接得到所需要的产物，但是可以获得重要的药物前体w。
相比于传统的生产方式，这些药物前体的纯度更高、安全 性更好，且制备成本较低。
可以说，在生物制药领域，细 胞工程扮演着重要的角色。
1. 细胞工程的简介所谓细胞工程，就是应用细胞融合、核移植、组织细 胞培养等技术，对细胞进行改造，从而改变细胞性状，获 得某些生物制品的技术。
在离体条件下，各种细胞的生 长、繁殖特性不尽相同，因此，需要通过细胞的生长状 态，对细胞生长所需的营养素、调节因子，以及其他培养 条件进行分析，并不断改善其培养环境，从而使细胞的产 出速率更高。
细胞工程的应用十分广泛，它既可以用于培 养作物的新品种，也可以用于药物、疫苗等的生产。
动物细胞工程教案
动物细胞工程教案一、教学目标1. 了解动物细胞工程的基本概念和原理。
2. 掌握动物细胞培养的基本步骤和操作技术。
3. 了解动物细胞融合的方法和应用。
4. 理解动物细胞工程在生物技术和医学领域的应用。
二、教学内容1. 动物细胞工程的定义和原理解释动物细胞工程的概念介绍动物细胞工程的基本原理2. 动物细胞培养的基本步骤动物细胞培养的流程和操作方法培养基的选择和配制细胞的分离和培养3. 动物细胞融合的方法介绍动物细胞融合的原理和方法细胞融合技术的应用和意义4. 动物细胞工程的应用动物细胞工程在生物技术领域的应用动物细胞工程在医学领域的应用三、教学方法1. 讲授法讲解动物细胞工程的基本概念和原理介绍动物细胞培养的基本步骤和操作技术2. 实验法进行动物细胞培养实验展示细胞融合技术的实验操作3. 案例分析法分析动物细胞工程在实际应用中的案例讨论动物细胞工程的优势和局限性四、教学评价1. 课堂参与度学生参与课堂讨论和问题解答的情况2. 实验报告评估学生在动物细胞培养实验中的操作技能和结果分析3. 小组讨论评估学生在案例分析中的思考和团队合作能力五、教学资源1. 教材和参考书籍《动物细胞工程》教材或其他相关书籍2. 实验材料和设备动物细胞培养实验室设备和材料3. 多媒体教学资源教学PPT、视频资料等相关教学资源六、教学步骤1. 引入：通过展示动物细胞工程的实际应用案例，引起学生对动物细胞工程的兴趣和好奇心。
2. 讲解：详细讲解动物细胞工程的基本概念、原理和基本步骤，包括动物细胞培养和细胞融合技术。
3. 演示：进行动物细胞培养实验，展示细胞融合技术的实验操作，让学生直观地了解动物细胞工程的技术过程。
4. 实践：学生分组进行实验操作，亲身体验动物细胞培养和细胞融合技术，培养学生的实践能力。
5. 讨论：组织学生进行小组讨论，分析动物细胞工程在实际应用中的案例，探讨动物细胞工程的优势和局限性。
七、教学安排1. 课时：本课程共计15课时，包括9课时理论教学和6课时实验教学。
细胞工程实验室配置及基本技术
用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨
醇等。
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§3.培养条件
六.气体影响
CO2、 O2
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§3. 培养条件
六.气体影响
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类 二.有机化合物 三.植物激素 四.其它附加成分
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类
消毒器、紫外灯。
无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、
摇床、 生物反应器等。
细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。
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§2.实验室设置
二.基本设备配置
灭菌设备
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§3.培养条件
四.pH值
通常使用的pH值范围是5.0～6.5。pH在 4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
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§3.培养条件
五.渗透压
事实上为了某些培养需要，在设计培养基
时就应该考虑渗透压的问题，如White培
养基的渗透压为0.15个大气压，MS培养基
为1.9个大气压。此外，培养基的渗透压除
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§2.基本技术
一.洗涤技术
洗涤方法 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。 第12页/共32页
动物细胞工程实验
实验一机械法分离培养动物细胞及计数一.实验目的1.掌握机械法分离培养动物细胞的原理及方法2.掌握细胞计数的方法二.实验原理在机体中，器官通常由几种组织构成，组织又由细胞通过紧密连接锚定连接、通讯连接构成组织。
采用机械法破坏细胞间的连接，能获得单个细胞。
本实验采用剪碎小白鼠肝组织的方法获取单个肝细胞，该方法简单易行。
三.实验材料1.动物：小白鼠（成年）2.试剂：PBS缓冲液，RPMI-1640培养液3.器材：手术器械、试管、滤网、离心管、离心机、显微镜等；四.实验方法1.无菌获取肝组织取成年小白鼠一只，断颈处死，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精洗碘。
剪开腹壁，暴露肝脏组织，换手术器材，剪取0.3mm3肝脏组织块，置于培养皿中。
2.获取细胞剔除脂肪组织，加PBS缓冲液1ml，反复冲洗2-3次，剪碎组织块至1mm3，加RPMI-1640培养液，滤网过滤至离心管。
平衡、离心（1000rpm,5min），弃上清，加培养液1ml，吹打均匀，成细胞悬液。
3.细胞计数取细胞计数板一个，盖上盖玻片，去细胞悬液，沿盖玻片便于滴1滴，显微镜下计细胞数，原则：计上不计下，计左不计右4.细胞培养加细胞培养液，稀释至1X105个/ml，移入培养皿，37℃，CO25%培养箱中培养四.实验结果实验二酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞一.实验目的掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法二.实验原理胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之剑的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+的存在下，才能行使这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价例子，使细胞被消成单细胞状态；本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉细胞获得单个细胞。
三.实验器材1.试剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA，PBS2.器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，血球计数板，离心管等3.材料：怀孕13-17天母鼠四.实验步骤1.取材：断颈处死怀孕小鼠，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘，剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中2.剔除和清洗：从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次3.剪碎：将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3（剪15-20min）4.消化：加入4ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化5-7min5.终止：加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化6.收集细胞：离心用100目滤纱将细胞悬液过滤至离心管中，平衡离心（1000rpm,5min）7.制备细胞悬液：弃上清，加1ml1640培养液，吹打成细胞悬液8.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察9.细胞计数：按上一实验介绍方法计数10.培养细胞：将稀释至1X105个/ml细胞悬液加入培养皿中，置于5%CO2，37℃，75%湿度培养箱中培养实验三牛镜子细胞冷冻与活率检验一.实验目的1.掌握细胞冷冻解冻原理及方法2.掌握细胞活率检验原理及方法二.实验原理细胞培养液中加冷冻保护剂，并通过一定的冷冻程序冷冻细胞，一方面使细胞内形成的结晶体积较少，减少对细胞的机械性损坏；另一方面缓解细胞内因结晶引起的局部高渗对细胞的伤害。
010细胞工程-第一章细胞培养室的设置和准备工作
移液器 液体试剂精确 取量 电动移液器、 微量移液器、 多通道可调式 微量移液器
使用与校对 1、枪头：一次性 2、轴芯，密闭性 3、第一档、第二档（深入液体4毫米） 4、校对
培养用器皿： ①培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、 无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。
精确的pH值测 定
注意事项：
1、不要用滤纸擦拭玻璃膜 2、严禁在脱水性介质如无水乙醇、重铬酸钾等中使 用
3、电极不能用于强酸、强碱或其他腐蚀性溶液
二、动物细胞工程实验室常用设备
• CO2培养箱：温度 湿度 酸度PH
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％ CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
注意事项：压力、消毒、蒸馏水
显微操作仪
细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割必需之设备
细胞电融合仪
采用高频交 流波，使细 胞排列成双 体或串珠状， 再使用直流 方波长脉冲 使细胞融合。
摇 床：进行细胞悬浮培养，水平往复式或回旋式
• 细胞冷冻储存器：
• 细胞培养工作中常需储存细胞，常用的是 液氮容器。液氮容器根据使用需要分为不 同的类型及多种规格。
离子交换纯水尚不能有效去除有机物，因此用水 时尚需再次蒸馏。
进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均 需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗， 也应使用2次以上蒸馏水。
• ，使用方便、安全，蒸馏速度快。
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
MRO反渗透系列纯水机 ：出水量（25℃）：8升/小时，15 升/小时 瞬间出水量：1.5升/分(需选配压力储水桶) 出水水质：反渗透水 Millipore公司：MPC超纯水系列标准型水源（一馏水或自 来水）→ 预处理（PP棉滤、活性碳。去除了水中的颗粒与 降低了自来水中余氯的含量） → 反渗透膜（去除绝大部分 的细菌，离子及有机物） → 储水箱 → 4组抛光混柱(除去 残留在水中的离子与有机污染物) → UV紫外灭菌（杀灭细 菌，进一步降低TOC）或超滤UF（滤掉内毒素同时去除大 量有机物） → 终端滤器（彻底除菌、除颗粒，极低TOC的 超纯水）
细胞工程基本技术
四、培养用品的清洗
在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培 养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。
清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长 的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。
三．电离辐射消毒
○ 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。
三．湿热灭菌
湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效 的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器 皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。
各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般 培养用液、橡胶制品要求10磅(114℃)，10～ 20分钟或8磅(112℃)30分钟。布类、玻璃制 品、金属器械等为15磅(12l℃)20分钟。
玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤器根据滤板的孔 径分为G1一G6几种规格，一般采用G6型(孔径在1.5μm以下)， 可达到除菌目的。
微孔滤膜滤器，应选用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌。 各种滤器必须先经高压蒸气消毒、烤干后方可使用。
2. 化学消毒法
3. 消毒剂
○ 细胞培养室的工作面、家具、墙壁、地面和空气等可用消毒剂进 行灭菌处理。如：75％酒精常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒； 0.1％新洁尔灭是目前最常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操 作面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒：来苏儿可用于 地面消毒；过氧乙酸消毒能力很强，在0.5%的浓度下，10min 就可将芽孢菌杀死。甲醛是一种光谱灭菌剂，其水溶液和气体对 各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
○ 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观 上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响 到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。 可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行 检测。