PCR技术原理讲解及人的SRY基因扩增
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR扩增的原理和步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种能够在体外迅速扩增DNA片段的技术，它在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。
PCR扩增技术的原理和步骤对于理解PCR的应用和优化至关重要。
本文将详细介绍PCR扩增的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和应用PCR技术。
首先，PCR扩增的原理是基于DNA的复制原理。
PCR技术通过反复的循环使DNA片段在体外进行复制，从而实现对DNA片段的快速扩增。
PCR扩增的关键在于PCR反应体系中的DNA聚合酶能够在一定温度下，以DNA模板为基础，合成新的DNA链。
PCR扩增的原理是通过不断重复三步循环来实现的，这三步循环包括变性、退火和延伸。
PCR扩增的具体步骤如下：1. 反应体系的准备，首先需要准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液、DNA聚合酶等。
这些成分在PCR反应中起着不同的作用，其中DNA聚合酶是实现DNA扩增的关键酶。
2. 变性，PCR反应开始时，反应体系中的DNA双链在高温下会变性，即DNA 双链会解开成两条单链。
这一步是为了使DNA分子解开，为后续的DNA复制提供单链DNA模板。
3. 退火，在变性后，反应体系中的温度会降低，引物与单链DNA模板结合，形成引物-模板复合物。
引物是在PCR反应中用来引导DNA聚合酶复制DNA的短链DNA片段，它们与DNA模板的序列相互配对。
4. 延伸，在引物-模板复合物的作用下，DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
在延伸过程中，DNA聚合酶将dNTPs加入到新合成的DNA链中，形成双链DNA。
这一步是PCR扩增的关键步骤，也是实现DNA扩增的重要环节。
5. 重复循环，上述三步循环反复进行，每一个循环都会使DNA片段的数量成倍增加。
通过多次循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
总结，PCR扩增技术是一种快速、高效的DNA扩增技术，其原理和步骤相对简单易懂。
pcr扩增技术的原理
PCR扩增技术的原理一、PCR扩增技术的概述PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于在体外复制DNA片段的技术，是分子生物学中最基本和最重要的实验手段之一。
PCR扩增技术通过反复复制目标DNA 片段，使其数量指数级增加，从而达到检测、分析和研究DNA的目的。
二、PCR扩增技术的基本原理PCR扩增技术基于DNA双链的特性和DNA聚合酶的功能，通过三个简单的步骤重复进行，包括变性、引物结合和延伸。
2.1 变性（Denaturation）变性是PCR扩增的第一步，通过加热使目标DNA的双链解离为两股单链。
传统PCR 通常在94-98摄氏度下进行变性，以确保DNA的完全解离。
2.2 引物结合（Annealing）引物结合是PCR扩增的第二步，将引物引导到目标DNA的特定位置上。
引物是短的单链DNA片段，一般有18-30个碱基对，能够与目标DNA序列的两端互补配对。
2.3 延伸（Extension）延伸是PCR扩增的第三步，通过DNA聚合酶的作用，在引物的引导下合成新的DNA 链。
在PCR反应中，常用的DNA聚合酶是从热水生物（Thermus aquaticus）中分离得到的热稳定聚合酶（Taq聚合酶），它能够在高温下保持活性。
三、PCR扩增技术的优势PCR扩增技术具有许多优势，使其成为分子生物学中最为广泛应用的技术之一。
3.1 高度特异性PCR扩增技术通过引物的选择，可以高度特异性地扩增目标DNA片段，排除其他非特异性DNA的干扰。
3.2 高度敏感性PCR扩增技术的灵敏度非常高，可以扩增出仅有几个分子的DNA片段。
这使得PCR 在致病微生物的检测和疾病早期诊断等领域发挥了重要作用。
3.3 快速和高效PCR扩增技术只需几个小时就可以获得充足的目标DNA片段，相比传统DNA克隆方法，时间和效率都有极大的提升。
3.4 可应用于各种DNA样本PCR扩增技术对DNA样本的要求较低，可以从各种来源（例如血液、组织、体液、植物、微生物等）中提取DNA，并进行扩增。
高三生物pcr扩增知识点
高三生物pcr扩增知识点PCR（聚合酶链式反应）是现代生物学中一项重要的技术手段，它在分子生物学研究和遗传工程领域扮演着至关重要的角色。
本文将围绕PCR扩增的基本原理、关键步骤和应用领域展开介绍。
一、PCR扩增的基本原理PCR扩增是一种将DNA特异性扩增至大量的技术手段。
其基本原理是通过加热使DNA两个链分离，加入引物使其作为启动子，并在酶的作用下合成新链。
这个循环过程会重复多次，从而使DNA的数量指数增加。
二、PCR扩增的关键步骤PCR扩增一般包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：PCR反应开始时，将DNA样本加热至95℃，使正常结构的DNA分子解链成为两条单链DNA。
这个步骤通常称为变性。
2. 退火：在变性后，PCR反应体系降温至退火温度，引物与目标DNA序列的互补区域发生杂交。
引物通常由两个核苷酸序列组成，一个位于目标序列的5'端，另一个位于目标序列的3'端。
引物的选择对PCR扩增的效率和特异性至关重要。
3. 延伸：在杂交后，加入DNA聚合酶，该酶能以引物为起始点，在退火的条件下延伸核苷酸链。
这个步骤通常被称为延伸。
延伸产生的产物是在目标DNA序列中间的一个复制片段。
三、PCR扩增的应用领域PCR扩增技术广泛应用于生物学研究和遗传工程领域，下面列举了一些常见的应用领域。
1. 分子生物学研究：PCR可以用于从复杂的基因组中增加特定的DNA片段，以分析基因的表达模式、基因序列的变化等。
此外，PCR还可用于检测病毒、细菌和其他病原体的存在，并鉴定它们的种类和亚型。
2. 遗传工程：PCR技术对于基因克隆和转基因研究具有重要意义。
通过PCR扩增，可以得到大量的目标DNA片段，进一步进行基因克隆和宿主细胞中的表达。
3. 古生物学研究：PCR在古生物学研究中扮演着非常重要的角色。
通过从化石组织中的DNA提取并进行PCR扩增，可以获取古生物材料的遗传信息，从而了解古生物的进化和分布。
PCR扩增原理及操作教学内容
PCR扩增原理及操作教学内容PCR（聚合酶链反应）是一种基因分析技术，被广泛应用于分子生物学和基因工程中。
PCR的原理是通过体外扩增DNA的特定片段，从而获得大量的DNA样本。
下面是对PCR扩增原理及操作教学内容的详细介绍。
一、PCR扩增原理1.变性：将待扩增的DNA样本加热至95℃，使DNA双链解开成两根单链，也即变性。
这个步骤通常需要持续30秒至2分钟。
2.退火：将温度降低至退火温度（通常为50-68℃），此时引物结合于待扩增的DNA模板的互补序列上。
引物是短的DNA片段，它的序列与待扩增的目标序列的两端互补。
退火的目的是让引物通过特异性互补序列，限定DNA双链的延伸范围。
这个步骤通常需要持续30秒至2分钟。
3. 延伸：将温度升高至72℃，此时DNA扩增酶（如Taq聚合酶）开始工作，以模板DNA为引物，在核苷酸三磷酸(NTP)的存在下，合成新的DNA链。
这个步骤的时间取决于需要扩增的DNA片段长度，通常为每kb 需延伸5-10秒。
这三个步骤构成了一个PCR循环，每个循环都会使DNA含量翻倍。
通常需要进行多次循环，才能得到足够的DNA量。
进行PCR扩增通常需要以下步骤：1.材料准备：-待扩增的DNA样本：可以是基因组DNA、cDNA或从已有样本中提取的DNA片段。
-引物：需要设计两个引物，一个位于目标序列的起始端，另一个位于目标序列的终止端。
-dNTPs：四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
- PCR缓冲液：包含足够量的Tris-HCl缓冲液、MgCl2和pH调节剂。
- PCR扩增酶：如Taq聚合酶。
-模板DNA扩增物浓度已知的正对照DNA样本和阴性对照DNA样本。
2.PCR扩增体系的制备：按照PCR反应的需要，将材料按照一定的比例配制成PCR扩增体系。
通常的PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、DNA样本和PCR扩增酶。
3.反应条件设置：根据具体扩增的DNA片段长度，合理设置PCR反应的温度和时间。
PCR基因扩增技术原理及特点
PCR基因扩增技术原理及特点基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重点革新。
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA 双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对依据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。
此引物范围就在包含所欲扩增的DNA片段，一般需20—30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。
引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原材料按5到3方向将引物延长、自动合成新的DNA 链、使DNA重新复制成双链。
然后又开始第二次循环扩增。
引物在反应中不但起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。
新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。
如此重复上述DNA模板加热变性双链解开引物退火复性在DNA聚合酶作用下的引物延长的循环过程，使每次循环延长的模板又加添1倍，亦即扩增DNA产物加添1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。
E为PCR循环扩增效率。
设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。
可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。
PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵从酶促动力学原理。
靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的渐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶实现肯定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再加添，即显现所谓平台效应。
PCR技术原理讲解及人的SRY基因扩增
移液器pipette
枪头tips
反应管tube
95℃ 3min； 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 30个循环； 72℃ 延伸5min
核酸电泳
1 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适 宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉; 加入到配胶用的三角烧瓶内;定量加入电泳缓 冲液
PCR技术的特点
1 高度的灵敏性
30轮循环扩增量达230个拷贝109拷贝
2 特异性 3 操作简便易行 4 用途广泛
PCR技术的应用
生命科学：DNA重组 转基因生物 医学工程：基因疫苗 产前诊断 疾病诊断：艾滋病 禽流感 法医学：血迹 精斑等痕迹DNA 考古学：远古人类 猛犸DNA
人的性别决定
➢Khorana1971等提出在体外经DNA变性;与适当引 杂交;再用DNA聚合酶延伸;克隆DNA的设想
➢1983年;Mullis发明了PCR技术;使Khorana的设想得 到实现
➢1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶Taq引入了PCR技术
➢1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首;比喻1989年为PCR爆炸年;Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖
PCR技术原理及人SRY基因扩增
DNA的结构
DNA的复制
模板：基因组DNA 原料：游离的核苷酸
AGCT 催化剂：DNA聚合酶 需要的条件： 活细胞内的微观环境
DNA的复制
DNA的复制
体内in vivo
体外in vitro
PCR技术的发明
Californian highway
Kary B Mullis
6 接通电源;红色为正极;黑色为负极;切记 DNA样品由负极往正极泳动 靠近加样孔的 一端为负；根据指示剂泳动的位置;判断是 否终止电泳
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常见的分子生物学方法，它可以快速、特异地扩增指定DNA序列，使其生成高精度的结果。
PCR是一种复杂的反应，但它的操作简单易学，变异及优化也相对简单。
由于它在生物学和医学研究中起着重要作用，因此认识其原理和操作让学者受益匪浅。
一、PCR的原理PCR是一种高效的PCR扩增方法，它利用特定的双螺旋DNA序列上的原核聚合酶作为标记，以及特定的模板序列，来实现对DNA 构建的扩增。
这种扩增过程通过重复建立定向复制来实现，该过程是以三个基本步骤为特征：建立、扩增和重组。
建立步骤是通过原核聚合酶（Taq）将双螺旋DNA序列的3‘端与模板序列上的5’端配对的过程。
这个过程被称为primer平衡，它利用模板序列前后的双链DNA，通过配对合成特定序列的核苷酸，从而形成一个新的DNA二聚体。
扩增步骤利用聚合酶的功能，以双螺旋DNA为模板，合成一条短的DNA条带。
在这个过程中，聚合酶将给定的核苷酸与模板序列上的一对核苷酸配对，并将front end在模板序列上已配对的核苷酸复制一次。
这一步骤可以重复多次，从而形成一条由少量核苷酸构成的DNA条带。
重组步骤是扩增过程中最后一步，是DNA双螺旋在高温条件下重新组装的过程。
当DNA双螺旋分裂，重新组装时，其中一个螺旋将配到模板序列上的DNA另一螺旋上，从而形成一对正反对称的DNA。
此外，这一步还会导致重组的DNA序列崭露出来，形成双聚体，并伴随着一些特异性多聚体的形成。
二、PCR的步骤PCR的步骤大体如下：1.样本准备：在实验中，要使用的样本是由某种实验物质（如DNA，RNA等）组成的混合液，因此需要将实验物质分离并准备好。
2.DNA扩增：在DNA扩增步骤中，混合液中的DNA片段将在指定温度下经历几次复制，从而形成大量的高精度的DNA片段。
3.电泳：在电泳步骤中，将DNA片段放入泳管中，然后电压按照指定的条件施加，以分离不同长度的DNA片段。
PCR扩增原理及过程
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7
3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板 是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一 般要有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应 避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影 响扩增的效果，一般要求含量合适，3ⅹ105分子数（1μg） （提高产量，减少非特异性扩增）；
引物的5′端决定着PCR产物的长度， 它对扩增特异性影响不大。因此，可以被 修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰 包括：添加酶切位点；生物素、地高辛、 荧光等标记；引入蛋白质结合DNA序列； 引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任 何修饰。
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1
第一节 PCR技术原理和工作方式
• 一、PCR的基本原理
• 1、基本要素和扩增原理
• DNA的复制是生命活动中最基本的过程之 一，PCR的基本原理离不开DNA复制的基 本规律。在PCR过程中模板可以是双链 DNA也可是单链DNA，最后扩增出来的是 双链状态的。其中引物是DNA复制中不可 缺少的。
若DNA组成比较单一，则变性发生在狭 窄的温度范围内.
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5
二、PCR反应体系
PCR反应需要在一定的条件下才能完成，只有 这些条件协调作用时才能达到很好的效果。 1、缓冲液 2、脱氧三磷酸核苷（dNTP） 3、引物 4、模板 5、DNA聚合酶
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6
1、 缓冲液：
缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应 进行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增 的特异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓 度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选 出最适的Mg2+浓度。
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移液器（pipette）
枪
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95℃ 3min； 94℃ 30s、 52℃ 30s、 72℃ 30s 30个循环； 72℃ 延伸5min.
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核酸电泳
1. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适 宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉， 加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓 冲液。
➢1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
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PCR技术的特点
1 ）高度的灵敏性
30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）
2 ）特异性 3 ）操作简便易行 4 ）用途广泛
Californian highway
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➢Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引 物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。
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模板：基因组DNA 原料：游离的核苷酸
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人的性别决定
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人的性别决定
Father
Mother
22pairs+XY
22pairs+XX
sperm
利用PCR技术检测SRY基因
男性，有SRY——阳性结果 男 女 女性，无SRY——阴性结果
应用：奥运会运动员的性别鉴定 犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定 野生动物的性别鉴定······
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反应体系
总体积
Buffer dNTP Primer DNA分子 Taq酶
25 l
缓冲液 原料 引物 模板 DNA聚合酶
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7.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观 察电泳带及其位置。
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22+X 22+Y
egg
22+X
22pairs+XX
Girl
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22pairs+XY
Boy
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1959年生物学家发现Y染色体决定人（和老鼠） 的男性特征;
1975年，Wachtel等提出Y染色体上有一个组织相 容性抗原的基因H-Y和男性决定有关;
1987年, David Page认为Y染色体上一个特定的 基因ZFY是决定男性的基因;
1988年,澳大利亚的Sinclair实验室发现袋鼠类 的ZFY基因不在Y染色体上，而是在常染色体上;
1990年，澳大利亚女科学家Marshall Graves 和 英国的Lovell-Badge两个实验室发现另外一个基因 SRY。
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人的性别决定
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Y
SRY 男性
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5.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液 （loading buffer），混匀后，用枪将样 品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内 。
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6.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔 的一端为负)；根据指示剂泳动的位置，判 断是否终止电泳。
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2. 放入到微波炉内加热熔化
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3.冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转
以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其 凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝 胶安放在电泳槽内
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4.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过 胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法 除去。
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