天然抗菌肽分离纯化方法的建立
抗菌肽的分离纯化研究进展
XIANGCUN KEJI 2016年12期（下）43抗菌肽的分离纯化研究进展袁慧坤袁文华刁新平（东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨150030）［摘要］抗菌肽是抗生素的替代选择之一，具有较高的抗菌活性和与抗生素不同的作用机制，不易产生耐药性。
但是，天然抗菌肽的提取存在成本高、操作繁琐等缺点，因此需要加强对新型抗菌肽的研究。
本文主要对天然抗菌肽的优势、分离和纯化步骤进行综述。
［关键词］抗菌肽；分离纯化；结构测定［中图分类号］TS201.2［文献标识码］A ［文章编号］1674-7909（2016）36-43-2自1972-1975年从果蝇及惜古比天蚕中分离出天蚕素（Cecropin ）以来，抗菌肽便受到广泛的关注。
抗菌肽（Antimicrobial Peptide ）又被称为肽抗生素（Peptide Antibiotics ）。
抗菌肽的来源广泛，大多数生物体的自然防御系统内均含有抗菌肽。
抗菌肽对于已经产生抗生素耐药性的细菌具有有效的抑制作用，不易产生耐药性，所以抗菌肽成为具有极大研究潜力的物质。
1抗菌肽的抗菌优势抗菌肽拥有的与传统型抗生素不同的抗菌机制，使得抗菌肽具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫等病原体活性高和靶向点多、耐药性低等优势。
抗菌肽的肽链长度相对较短，一般为15～50个氨基酸残基构成，其分子量小，更易于快速到达感染部位。
另外，抗菌肽可以不同功能类型联合使用或与抗生素互相联合发挥其协同效应，增强机体免疫能力。
2抗菌肽的分离纯化与结构测定分离纯化是天然抗菌肽获取过程中的一项重要环节，是进一步对抗菌肽的人工合成与机理研究的基础步骤。
分离纯化的过程复杂，对于未知成分和结构复杂的抗菌肽，其难度更大。
分离纯化的关键在于既要保持抗菌肽的生物活性，又要得到纯的单一活性的肽。
所以，在分离纯化阶段每操作一步都要对其抗菌活性进行检测，只有具备抗菌活性，才有必要进行接下来的试验，从而得到理想的单一活性肽。
2.1纯化前处理在分离纯化步骤前，要注意对样品的前处理：若抗菌肽存在于体积偏大的有机体内的组织或器官，应在提取前将其按照不同组织或器官分类；若抗菌肽存在于机体偏小至难分割状态时，要使整个机体作为提取的对象。
抗菌肽Lactoferricin基因的PCR合成及克隆载体T-Lfn的构建
研究方向为食品微生物 及食品安全 。
Ｐ Ｒ反应体系为 ：１ × Ｃ Ｃ ０ Ｐ Ｒ缓 冲溶液 ２ Ｌ ．Ｉ ， ０ Ｌ
了 Ｔ Ｌｎ — ｆ 克隆载体，为 基因在生物体内的表达
作 准备 。
Ｔ Ａ Ａ ＡＣ Ｇ ２ ６ ｐ ３ Ａ Ａ Ｔ ｎ ｒＧ ＧＡ Ａ Ａ Ｔ Ｇ ３ ，Ｐ （０ｂ ） Ｔ Ｃ ｒ 盯 ｒ
ＡＣＣＣ ＡＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＧＣＧ
１ 材 料 与方 法
惠赠 。
根 据 文献 【 ，以合 成 的 寡核 苷 酸引 物 Ｐ 和 Ｐ ６ ］ ｌ ２ 的 ３ 末端 短互补 序列退 火彤成小 段双链 ，从 而互 为 模板 ，通过 Ｐ Ｒ反 应合成长 １８ ｐ的基 因序列 Ｌｎ Ｃ ０ｂ ｆ。
１ 工具酶 和试 剂盒 ． ２ 限制性 内切酶 、Ｄ ＡＭａｋｒ Ｎ ｒｅ 以及 ＩＴ Ｐ Ｇ、ｘ ｇｌ —ａ、
海华舜 生物＿ 程有 限公 司 ；分子量标准蛋 白购 自 Ｔ
ＭＢ ｅｍ ｎａ 公 司 。 Ｉ ｒ ｅ ｔｓ Ｆ １３ 引物设 计 －
其分离纯化步骤繁琐 ，牛 Ｌｎ ｆ 可由牛 Ｌ 水解制得 ， Ｆ 其抗菌能力优于人源乳铁蛋白。随着多肽化学合成 技术 日 趋完善 ，利用多肽 自动合成仪可以准确合成
Ｅ ｏ Ｍ一 ０ ，并进行 Ｐ Ｒ鉴定、酶切鉴 定及测序 ，成功构建 了Ｌ ｃ ｆｒ ｉ 因克隆载体 Ｉｎ ｃｌＪ １９ ｉ Ｃ ａｔ ｅｒ ｎ基 ｏ ￣ Ｊ。 ｆ 关键词 ：抗 菌肽 ；乳铁 素 ；载体构建
抗菌肽的分离纯化研究进展
抗菌肽的分离纯化研究进展作者：袁慧坤袁文华刁新平来源：《乡村科技》2016年第36期[摘要] 抗菌肽是抗生素的替代选择之一，具有较高的抗菌活性和与抗生素不同的作用机制，不易产生耐药性。
但是，天然抗菌肽的提取存在成本高、操作繁琐等缺点，因此需要加强对新型抗菌肽的研究。
本文主要对天然抗菌肽的优势、分离和纯化步骤进行综述。
[关键词] 抗菌肽；分离纯化；结构测定[中图分类号] TS201.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2016）36-43-2自1972-1975年从果蝇及惜古比天蚕中分离出天蚕素（Cecropin）以来，抗菌肽便受到广泛的关注。
抗菌肽（Antimicrobial Peptide）又被称为肽抗生素（Peptide Antibiotics）。
抗菌肽的来源广泛，大多数生物体的自然防御系统内均含有抗菌肽。
抗菌肽对于已经产生抗生素耐药性的细菌具有有效的抑制作用，不易产生耐药性，所以抗菌肽成为具有极大研究潜力的物质。
1 抗菌肽的抗菌优势抗菌肽拥有的与传统型抗生素不同的抗菌机制，使得抗菌肽具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫等病原体活性高和靶向点多、耐药性低等优势。
抗菌肽的肽链长度相对较短，一般为15～50个氨基酸残基构成，其分子量小，更易于快速到达感染部位。
另外，抗菌肽可以不同功能类型联合使用或与抗生素互相联合发挥其协同效应，增强机体免疫能力。
2 抗菌肽的分离纯化与结构测定分离纯化是天然抗菌肽获取过程中的一项重要环节，是进一步对抗菌肽的人工合成与机理研究的基础步骤。
分离纯化的过程复杂，对于未知成分和结构复杂的抗菌肽，其难度更大。
分离纯化的关键在于既要保持抗菌肽的生物活性，又要得到纯的单一活性的肽。
所以，在分离纯化阶段每操作一步都要对其抗菌活性进行检测，只有具备抗菌活性，才有必要进行接下来的试验，从而得到理想的单一活性肽。
2.1 纯化前处理在分离纯化步骤前，要注意对样品的前处理：若抗菌肽存在于体积偏大的有机体内的组织或器官，应在提取前将其按照不同组织或器官分类；若抗菌肽存在于机体偏小至难分割状态时，要使整个机体作为提取的对象。
抗菌肽的分离纯化方法
抗菌肽的分离纯化方法
抗菌肽的分离纯化方法通常包括以下步骤：
1. 提取：从生物样品中提取抗菌肽，可以使用不同的提取方法，如溶剂提取、离子交换、凝胶过滤等。
2. 分离：使用不同的分离技术将抗菌肽与其他组分分离，常见的分离技术包括层析（如逆相层析、离子交换层析、凝胶层析等）、电泳（如凝胶电泳、等电聚焦电泳等）和超滤等。
3. 纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，除去杂质和其他蛋白质，使目标抗菌肽得到纯化。
常见的纯化技术包括高效液相色谱（HPLC）、凝胶过滤和透析等。
4. 洗脱：将纯化的抗菌肽从分离材料中洗脱出来，一般使用适当的洗脱缓冲液（如酸性溶液、有机溶液等）。
5. 鉴定：通过质谱分析、氨基酸测序等方法对纯化的抗菌肽进行鉴定和表征，确定其结构和属性。
总的来说，抗菌肽的分离纯化方法需要根据具体实验目标和条件选择合适的提取、分离和纯化技术，以获得高纯度的抗菌肽样品。
抗菌肽相关实验报告结果
一、摘要抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点。
本实验旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术分离纯化抗菌肽，并通过抑菌圈法测定其抗菌活性。
实验结果表明，成功分离纯化了抗菌肽，并测定了其最小抑菌浓度（MIC）。
二、引言抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，广泛存在于各种生物体内，如昆虫、鱼类、两栖动物和哺乳动物等。
抗菌肽具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点，因此在抗菌药物的研究和开发中具有广阔的应用前景。
本实验通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，并对其抗菌活性进行测定。
三、实验材料与方法1. 实验材料抗菌肽粗提物：购自某生物科技公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌：购自某微生物研究所；甲醇、乙腈：色谱纯；其他试剂：分析纯。
2. 实验仪器高效液相色谱仪（HPLC）：某品牌；细菌培养箱：某品牌；无菌操作台：某品牌；电子天平：某品牌；抑菌圈测定仪：某品牌。
3. 实验方法（1）抗菌肽的分离纯化将抗菌肽粗提物溶解于适量甲醇中，采用反相高效液相色谱法进行分离纯化。
色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（梯度洗脱）；流速：1.0mL/min；检测波长：215nm。
（2）抗菌活性的测定采用抑菌圈法测定抗菌肽的抗菌活性。
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别接种于琼脂平板上，待菌落长成后，将抗菌肽溶液滴加于平板上，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。
四、实验结果与分析1. 抗菌肽的分离纯化通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，得到单一峰，证明抗菌肽已成功分离纯化。
2. 抗菌活性的测定（1）金黄色葡萄球菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC为10-7mol/L，抑菌圈直径为16mm。
（2）大肠杆菌抗菌肽对大肠杆菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为15mm。
（3）白色念珠菌抗菌肽对白色念珠菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为14mm。
抗菌肽生产工艺
抗菌肽生产工艺抗菌肽是一类具有天然抗菌性质的小分子肽链，其具有广泛的抗菌谱和高度的抗菌活性。
抗菌肽可通过化学合成、天然提取和基因工程等多种方法获得，下面将介绍一种抗菌肽的生产工艺。
首先，选择合适的产菌菌株。
通常采用大肠杆菌作为生产抗菌肽的宿主菌株。
因为大肠杆菌具有简单易操作和高效产菌的特点。
同时，根据具体需要选择合适的抗菌肽基因进行克隆。
其次，将目标抗菌肽基因插入到适当的表达载体中。
表达载体一般含有抗生素标记基因和诱导表达基因。
其中抗生素标记基因用于筛选正常转染的菌株，而诱导表达基因用于在适当的条件下促进目标基因的高效表达。
然后，将获得的表达载体导入到大肠杆菌中。
这一步骤一般采用电转化或化学转化等方法。
通过电击或化学处理，使表达载体进入大肠杆菌并获得抗生素抗性。
接着，通过发酵培养得到大量的抗菌肽。
将经过转化的大肠杆菌接种到发酵培养液中，控制合适的培养条件，例如温度、pH值、培养时间和培养基组分等。
在培养过程中，通过抗生素筛选和诱导表达基因的控制，使大肠杆菌高效产生抗菌肽。
并且在培养皿中还可以添加合适的诱导剂来提高抗菌肽的表达量。
培养时间一般为12-24小时。
最后，通过离心和纯化得到纯净的抗菌肽。
将发酵液进行离心，去除细胞碎片和杂质。
然后利用离子交换层析、凝胶过滤、逆流层析等技术对抗菌肽进行纯化。
最终得到纯净的抗菌肽。
以上就是一种抗菌肽的生产工艺。
随着生物工程技术的不断发展，抗菌肽的生产工艺也在不断改进和创新，以提高抗菌肽的产量和质量。
抗菌肽的广泛应用有望在医药、食品和农业领域等发挥重要作用。
抗菌肽的提取分离及抑菌机理研究进展
Ｍｏ ｄ ｅ ｒ ｎ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
２ ０ １ ４ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ０ ， Ｎｏ ． １
抗菌肽 的提取分离及抑菌机理 ’ ，曹庸 ’
（ １ ． 华南农业大学食品学院，广东广州 ５ １ ０ ６ ４ ２ ） （ ２ ． 钦州学院 海洋学院，广西钦州 ５ ３ ５ ０ ０ ０ ）
摘要：传统杀菌剂和抗生素的长期 大量使用不但导致部分病原微生物和环境害 虫产生耐药性，同时也存在着严重的环境和健康 风险 。因此继续寻找和开发不易产生耐药性的新型抗 菌物质显得 非常迫切 ，也具有重要意义，天然抗菌肽是一类小分子 阳离子肽，是
Ｐｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ
ＭＩ ＡＯ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｙ ｉ ｎ ， ＫＥ Ｃｈ ａ ｎ ｇ ， ＧＵＯ Ｈａ ｏ ． ｘ ｉ ａ ｎ ， ＬＩ Ｕ Ｇｕ ｏ １ ＧＡＯ Ｘｉ ａｎ ｇ － ｙａ ｎ ｇ ， ＣＡＯ Ｙｏ ｎ ｇ
，
（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ａｇ ｉ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ ０ ６ ４ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） （ ２ ． Ｏ ｃ ｅ ａ ｎ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｑ ｉ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｑ ｉ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ ３ ５ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
机体天然防御 系 统的重要组成部分。 它们具有较 宽的抗菌活性和 不同于传统抗生素的作用机制。 部分抗菌肽对革 兰氏阳性茵和革 兰氏 阴性 菌、 真 菌、寄生 虫、包 膜 病毒和癌细胞 均不同程度的抑制和杀伤作用。 抗 菌肽在抑制病原微生物方面的特性使其有望成为传统杀
一种纯化制备抗菌肽的方法[发明专利]
![一种纯化制备抗菌肽的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/87b8c258ae1ffc4ffe4733687e21af45b307fee5.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811277061.7(22)申请日 2018.10.30(71)申请人 成都诺和晟泰生物科技有限公司地址 610000 四川省成都市天府国际生物城（双流区生物城中路二段18号）(72)发明人 高剑 夏平安 钟国庆 龙小芳 冯智辉 张佳丽 李元波 (74)专利代理机构 成都行之专利代理事务所(普通合伙) 51220代理人 廖慧敏(51)Int.Cl.C07K 1/36(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/20(2006.01)(54)发明名称一种纯化制备抗菌肽的方法(57)摘要本发明公开了一种纯化制备抗菌肽的方法和装置，解决了现有技术中抗菌肽纯化时，无法使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。
本发明包括制取合成气的方法和装置，其中，方法包括：步骤一、制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。
本发明能够能使半透膜纯化和反向色谱法纯化相互促进，使纯度大于99％时其收率也达到50％以上。
权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 109180779 A 2019.01.11C N 109180779A1.一种纯化制备抗菌肽的方法，其特征在于，包括：步骤一、抗菌肽粗品通过纯化水溶解后过滤制得抗菌肽粗品溶液；步骤二、抗菌肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和纯化水中透析后获得抗菌肽初纯溶液；步骤三、将抗菌肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗菌肽精纯溶液；该反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min；步骤四、将抗菌肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗菌肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到抗菌肽成品。