siRNA 中文操作手册(lipo2000)
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
siRNA说明书
产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。
表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24〜72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。
注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
SiRNA 使用说明
因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)，请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液(试剂的用量和体积，请参照“转染 siRNA 用量参考”)： a. 稀释转染试剂 lipo2000：使用前，将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I
E-mail: support@
1
Tel: 020-32290221
实验指导
96-well 24-well 12-well 6-well
表 1 使用 lipofectamine2000(invitrogen)转染 siRNA 用量参考(siRNA 转染浓度为 10-100nM) V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000 混合液总体积
siRNA 使用说明
产品简介：
常规化学合成 siRNA 为 21-25nt 的双链小分子 RNA。即用型的 siRNA，已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的 ddH2O 或 RNase-free water 溶解并配制成 20µM 液体即可直接转染细胞。 产品剂型为冻干粉，产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
使用： 产品使用时，siRNA 最好冰上放置，使用完毕后，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无 RNA 酶环
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
siRNA 使用说明
Reduced Serum Medium)稀释，轻轻混和，室温孵育 5min； b. 稀释 siRNA：用 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释 siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后，与上述(b)稀释好的 siRNA 轻轻混和，室温培养 20min 以形成 siRNA-lipo2000
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THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
B. RNAi实验流程C. RNAi实验所需试剂试剂种类试剂用途siRNA oligo 与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补转染试剂如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染试剂Lipofectamin2000，电穿孔法等实验对照包括阴性和阳性及Mocking control基因表达的检测方法如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用western blotD. 上海吉玛 RNAi 相关产品普通siRNA Oligo上海吉玛 siRNA Oligo 是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA 冻干粉的产品形式提交给用户。
化学修饰siRNA Oligo上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA 作用时间相比，上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。
荧光标记siRNA Oligo荧光标记siRNA oligo 可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA 转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNA 还可用于siRNA 细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。
siRNA 阴性对照上海吉玛 RNAi negative control 与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。
荧光容易拍摄，它有很好的pH 耐受性，因而在活细胞中更稳定。
siRNA oligosiRNA 阳性对照上海吉玛 RNAi positive control 用于确定实验中转染、RNA 提取和检测方法的可靠性。
上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C 、GFP22、Luciferase GL2、MAPK1、Beta-Actin 、Vimentin 、P53、GAPDH 、Cyclophilin B 等。
siRNA 转染RNAi 转染试剂RNAi 转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse 活性，细胞毒性低。
适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA 高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清培养基中也能表现高转染效率； 4℃下可长期保存。
RNAi 表达 载体法shRNA 表达载体上海吉玛 shRNA 表达载体的特点是：克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1，可形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳定转染细胞系；GFP 报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi 发生位点。
上海吉玛现可提供8种 shRNA 表达载体，详见公司总目录C-6页。
Ezol RNA ExtractionReagent Ezol 试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA 提取；无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg ）还是大量的细胞（107）或组织（>1g ）都可得到出色的结果；操作简便，可实现RNA 的快速抽提。
核酸 抽提Enzol RNA ExtractionReagentEnzol 试剂是用于哺乳动物基因组DNA 抽提的试剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNA 提取。
通常使用本试剂，从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA ，从106-107Hela 细胞可以抽提到约25微克基因组DNA ，是一种简单、快速、高效、经济的方法。
RNAi-Startup GAPDHControl Kit本试剂盒可以用来优化siRNA 转染条件，也可作为RNAi 实验的内参使用。
荧光标记的dsRNA 可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR 方法准确评价转染前后GAPDH 基因的RNAi 抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。
RNAi-Startup GAPDHBasic Control Kit荧光标记的dsRNA 可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR 评价转染前后GAPDH 基因活性时,本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent （目录号QSG-070）。
RNAi Gene-KnockdownEasy Kit使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNA 及转染效率评价”到“实时RT-PCR 验证RNAi Knockdown 效果”的全部过程；荧光标记的dsRNA 可直观的观察细胞转染情况；内含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照及 PCR 扩增引物和探针，可应用定量PCR 方法直观评价转染效率及验证GAPDH 的RNAi 抑制效果；可作为RNAi 实验的阳性和阴性对照使用。
RNAi-Startup IFNResponse Basic Control Kit 哺乳动物细胞中长链的双链RNA （dsRNA ）能够诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。
如果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异性的IFN 效应，则可用本试剂盒进行验证；应用Real-Time PCR 检测非特异性IFN 效应时，本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent （目录号QSG-070）。
RNAi-Startup IFN Response Control Kit如果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异性的IFN 效应，则可用本试剂盒进行Realtime PCR 验证；同时检测PKR, OAS-1和 hStat1三个IFN 效应基因并提供GAPDH 管家基因对照；检测灵敏度高，结果直观且易于判断。
基因 表达 检测常备的RNAi 管家基因Control 试剂盒上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi 实验Control Kits ，以方便广大科研工作者开展RNAi 实验。
详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR 分册C8页。
Ⅱ. siRNA 设计A. 哺乳动物siRNA 设计哺乳动物siRNA 设计需要注意的几个方面1． 从转录本（mRNA ）的AUG 起始密码开始，寻找“AA ”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2． 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。
目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
3． siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4． 在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions ，UTRs ），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。
5． 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
6． 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST （/BLAST/）。
7． 选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA ，以找到最有效的siRNA 序列。
8． 阴性对照:一个完整的siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA 应该和选中的siRNA 序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性。
通常的做法是将选中的siRNA 序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。
9．有结果显示，UU 结尾和dTdT 结尾的siRNA 在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。
合成siRNA 时可直接提供以AA 打头的21个碱基序列。
B. 上海吉玛 siRNA 产品特点上海吉玛 拥有处于国际领先水平的siRNA 化学合成的全部核心技术，包括RNA 单体合成、普通siRNA 合成、化学修饰siRNA 合成、荧光标记siRNA 合成等。