二苯胺显色法测定DNA含量
DNA 的定量测定
实验六DNA 的定量测定（二苯胺法）一实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA(脱氧戊糖基）H+HO CH2C CH2CH2蓝色化合物DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。
当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。
三试剂和器材（一）器材1．粗制DNA。
2．坐标纸。
3．试管1.5 cm *15 cm （*7）4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。
5．722 型（或7220 型）分光光度计。
6．恒温水浴锅。
（一）试剂1．DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。
2．二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。
当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。
3．DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控制其DNA含量在100μg/ml左右。
四操作方法1．标准曲线的绘制按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃恒温水浴保温45 min，冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。
2．样品的测定吸取DNA样液1.0 ml，加入蒸馏水1.0 ml，混匀。
生化实验报告--DNA定量测定(二苯胺法)
DNA的定量测定-二苯胺法一、实验目的1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法；2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二、实验原理1．DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。
2．在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器试管移液管7220分光光度计四、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。
2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。
贮于棕色瓶中。
B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可五、实验验步骤1.标准曲线的绘制加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。
2.样品测定吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
根据实验数据制得标准曲线如下：由上表可知样液的吸光度y=0.115，则由标准曲线得出DNA样液的浓度x=18.49μg/ml。
故样品中DNA的质量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、实验分析1. 测定DNA含量的方法还有哪些原理?荧光法，用Pico Green荧光染料，测定DNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
2. 实验中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的断裂损伤,DNA在酸性条件下加热，在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度.。
DNA的提取及含量测定实验
[实验目的及要求]
1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA 的原理和方法； 2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理 和方法。
[实验原理]
Hale Waihona Puke 1．DAN的提取 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存 在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。动植物的 DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液 中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不 同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中 分别抽提出来。 2 DAN的含量测定 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊 醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。在 DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比， 可用比色法测定。
5 2.0
蒸馏水 /ml 二苯胺试 剂/ml
A595nm
2.0 4.0
1.6 4.0
1.2 4.0
0.8 4.0
0.4 4.0
0 4.0
样品的测定 吸取样品1.0mL，加入蒸馏水1.0ml，混匀。 然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于 60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm 波长，于722型分光光度计上比色测定，根据 测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
[实验仪器及用品]
实验器材：猪肝、722型分光光度计、匀浆器、 离心机、恒温水浴锅。 实验试剂：0.1mol/l NaCL-0.05mol/l柠檬酸钠 溶液、0.015mol/L NaCL-0.0015mol/L柠檬酸 三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、 氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂。
二苯胺的使用
⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。
⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。
鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
⼆苯胺试剂的配制A液： 15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。
B液： ⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。
DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。
2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。
在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。
沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。
⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。
⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。
5-二苯胺显色法测定DNA含量ppt
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样 品液的A260/A280比值和DNA浓度。
核酸紫外吸收光谱的测定
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在 260nm波长处。吸收紫外光的性质 是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质， 不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长 处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与 280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
一般性实验-5
二苯胺显色法测定DNA含量
Hale Waihona Puke 实验原理 DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后 形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－400µg范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙 醛，可提高反应的灵敏度。
DNA
H＋
二苯胺 HO－CH2－C－CH2－CH2－CHO ＝ O 蓝色化合物
岛津UV-120分光光度计
双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行 分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氘灯发出光的适宜范围在 150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。 使用石英杯作为比色杯。
二苯胺试剂鉴定DNA
二苯胺试剂：鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0。
1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1。
DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0。
14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺(沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1。
步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入.2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL 的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管(20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒(100 mL，1个），纱布，镊子,滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1。
析出溶解在NaC1溶液中的DNA.2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3。
DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA:3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.3 min6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。
二苯胺试剂鉴定DNA
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载二苯胺试剂鉴定DNA地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容二苯胺试剂:鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol ／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个， 50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
二苯胺试剂鉴定DNA的原理
二苯胺试剂鉴定DNA的原理二苯胺试剂鉴定DNA的原理一、定义二苯胺试剂（Diels-Alder Reagent）是一种有机化学试剂，用于识别DNA特定序列的定向性反应，也称为定向碱基异构酶（DBA）试剂。
该反应原理的应用有助于鉴定DNAsites的结构以及多段和复合份额的识别。
二、原理二苯胺试剂的反应受特定的DNA序列控制。
当两个特定的DNA序列（A和B）结合在一起时，二苯胺试剂不会发生反应。
当两个相邻的DNA同源片段（测序DNA被称为probe DNA）与目标DNA结合时，二苯胺试剂将发生化学反应，从而形成定向碱基异构化反应（DBAR）。
当两个DNA同源片段（A和B）以相反的方向连接在一起并且probe DNA与target连接在一起时，将发生相反的DBAR反应，从而允许研究人员确定多段复合份额结构和激活片段的位置。
三、步骤1. 准备试剂：用于鉴定DNA序列的二苯胺试剂主要包括：四氢三唑，苯胺试剂，deoxyuridine triphosphate（dUTP），十六烷基三甲基溴化氢，二硫代乙酸盐，硫酸铵，三氟异丙醇，氯化钠和氯仿。
2. 生物实验：首先，把一定量的DNA与二苯胺试剂，孵育物质以及制剂混合物一起混合搅拌，使其充分接触。
所得的混合物应放在微孔板的特定位置，经过30分钟的反应，可完成DNA的定向碱基异构化反应。
3. 检测结果：在用正片胶将实验测试物涂覆之后，用UV波长或紫外可见对应射线下照射，发现接受了二苯胺化学反应和定向碱基异构化反应的物质和连接物会吸收紫外线，通过经典的水滴检测法即可看到反应得到的结果。
四、应用二苯胺试剂技术可以用于鉴定DNA特定序列的结构，可以识别多复制份额DNA结构，可以用于对染色体进行谱系定向标记，可以用于精确的基因组生物学和染色体学研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
离心机的使用
打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧；
离心过程中不要用重物撞击离心机；
兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原 理和方法 掌握离心机的使用方法
实验原理
在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白的溶解度最低。 用0.15M氯化钠溶液洗涤可洗去其它物质。 沉淀用SDS处理，SDS使蛋白质与DNA解离，再用氯仿 －异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。 DNA溶液用乙醇沉淀析出。
加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。
SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。
加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白
相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要
吸到蛋白相。
CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出
逐滴加入0.5ml 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min
去塞！离心
挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解
加1ml 5M NaCl
吸取上清液 勿吸到中间层！
要等离心机完全停止转动后再打开盖子。
二苯胺显色法测定DNA含量
实验原理
DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊
醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在 595nm处最大吸收。每ml含20－400µ g范围内光密度与 DNA的浓度成正比。用标准曲线法测定DNA含量。 用生物分光光度计（用紫外光度法）分析DNA含量与 纯度
注意事项
尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。
实验操作
1. 弃上清留沉淀
兔肝
离心
1X SSC洗 两次
加至8ml 1X SSC
3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白）
称取4 g 加 8ml பைடு நூலகம்X SSC
离心
匀浆、过滤
2.弃上清留沉淀
取8ml匀浆液 离心
加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA
沉淀
等体积氯仿-异 丙醇混合液
加约2倍 体积 95% 乙醇
相当于该光密度值DNA的含量。
核酸紫外吸收的测定
核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在260nm处有最 大吸收，测A260/A280可得知核酸的大致纯度。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，调零，按“blank”。样品池中加 入样品，按“sample”，记录样品液的A260/A280比值和DNA浓度。
实验操作
取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于 595nm波长比色。 以光密度为纵坐标，DNA含量（µ g/ml）为横坐标，绘制标准曲线. 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标 “U”和“B”，按表加入试剂。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出