细胞增殖检测CFSE - 360文档中心

CFSE增殖实验

CFSE增殖实验CFSE增殖实验-江英骙PBMC增殖染色分2天第一天1.分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁；2.CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。

第二天1.收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。

先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）；2.CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管）3.细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）；4.37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）；5.直接离心，1800rpm，10min；6.加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min；7.离心，1800rpm，10min；8.再洗一遍，重复步骤79.R10+双抗重悬，计数；10.调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul11.每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热）12.放入大细胞房培养7天，收细胞；13.可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。

CFSE活染方法Protocol

三、CFSE 标记细胞
制作细胞悬液，加入等体积 CFSE 工作液，于 37℃孵育 10 min，用 40%体积的冷小牛血清立即终止标记 10min。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。
CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5-5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。
试剂盒成分
• CellTrace™ CFSE (Component A), 10 瓶，每瓶 50 μ g • DMSO (Component B), 0.5 mL
使用浓度：
一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为 5～10uM，活力分析等短时间分析为 0.5～ 5uM。荧光显微镜为 25uM。优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
5. 37 ℃，避光放置 10min。
6. 250g 室温离心 10 分钟。弃上清，加入含 10%FBS 的完全 1640 培养液洗 2 次。最后用 1ml R10 培养基（见附录 3）重悬。
7. 将上述细胞悬液加入 24 孔培养板,每孔 1mL,分别加相应的多肽库或者阳性刺激物 SEB（Sigma, Cat# ）刺激 ,终浓度 1ug/ml
1．1
重悬细胞于预温的 PBS/0.1%BSA，浓度 1×10 6 /ml。
注意：为保证标记均匀，样本需为单细胞悬液。细胞浓度为 10 5 ~10 6 ,依标记后细胞的培养
时间而定。若需传代培养，浓度增加为 1～5×10 7。
1．2
每 ml 细胞中加入 2ul CFSE 贮存液，终浓度为 10uM。注意：最适工作浓度需优化，
二、CFSE 配制
用 DMSO 溶解成 5 mmol/L 的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清 DMEM 培养液稀释成 5μ mol/L 的工作液备用。CFSE 试剂盒内有一小瓶 CFSE（A 试剂）标明 500ug ，另有一小瓶 DMSO（B 试剂），500ugCFSE 溶解于 180ulDMSO 即是 5mMstock solution。

cfse染料波长 -回复

cfse染料波长-回复CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl ester）染料是一种常用的细胞示踪染料，也被称为洋红荧光素。

它在生物医学和细胞研究中被广泛使用，因其明亮的荧光信号和良好的稳定性而备受青睐。

在这篇文章中，我们将一步一步地回答关于CFSE染料波长的问题，帮助读者更好地了解和使用这种重要的生物染料。

首先，我们需要了解CFSE染料的基本特性。

CFSE属于荧光素家族，其化学结构中包含苯并吡喃环并带有甲苯基的共轭二烯。

由于其结构的独特性，CFSE具有强大的荧光特性，可以有效地被激发和发射荧光信号。

CFSE染料的激发波长为494纳米，而发射波长为521纳米。

这意味着，当CFSE染料受到494纳米的激发光照射时，它会发出521纳米的荧光信号。

这一波长范围的选择是基于CFSE染料的吸收光谱和发射光谱的特性，以及所使用的荧光显微镜的光源和检测器的选择。

在细胞实验中，CFSE染料被广泛用作细胞示踪剂，可以用于追踪和定量细胞增殖、移行和分化等过程。

其原理是将CFSE染料与目标细胞一起孵育，然后通过细胞的代谢活性将CFSE染料转化为CFSE缀合物。

这些缀合物可在细胞的质膜内累积并由CFSE释放荧光信号。

通过测量细胞中的荧光强度，我们可以了解细胞在不同时间点的变化，用于评估细胞增殖率、迁移速度或分化程度。

除了波长的选择外，使用CFSE染料还需要考虑许多其他因素。

首先，选择适当的染料浓度非常重要。

通常，细胞染色需要在一定浓度范围内进行，以确保荧光信号的强度和稳定性。

对于CFSE染料，推荐使用的浓度范围为0.5到5微克/毫升。

其次，染色时间的选择也很重要。

在染色的初期阶段，CFSE染料被细胞摄取并在细胞内进行代谢转化。

随着时间的推移，CFSE染料开始积累并释放荧光信号。

染色时间的选择应基于特定细胞类型和实验目的，通常在30分钟至24小时之间。

最后，CFSE染料的稳定性也需要考虑。

CFSE细胞增殖实验

C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。

（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。

2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。

3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。

留取105个细胞进行FACS。

（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。

FlowJo分析细胞增殖

注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友给我留言打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。

3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。

随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。

如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。

用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。

CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。

这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

CFSE细胞增殖实验

C F S E细胞增殖实验Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。

（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。

2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。

3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。

留取105个细胞进行FACS。

（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。

CFSE

货号：C375 CAS NO：150347-59-4活细胞染色-Cellstain- CFSE化学名：5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacetylfluorescein 别名：CFSE结构式：分子式：C29H19NO11分子量：557.46价格：性质：外观：白色或浅黄色粉末纯度：>95.0% (HPLC)产品描述CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。

CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。

因此，CFSE 常被用来做活细胞检测试验和用荧光电镜观察细胞长期活动的试验。

CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm。

染色过程：1. 用DMSO制备1mM 的CFSE溶液。

用PBS或适当的缓冲液将其稀释成10-50 μM的CFSE溶液。

2. 将1/10细胞培养基体积的CFSE溶液加入到细胞培养基中。

3. 在37℃培养细胞15-30分钟。

4. 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。

5. 用490 nm激发波长，530 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

常见问题:储存条件：-20℃参考文献：细胞增殖检测：CFSE点击次数：1195 作者：佚名发表于：2008-07-28 12:43转载请注明来自丁香园来源：丁香园一、原理荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacet ate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。