锦鲤疱疹病毒ORF146基因的克隆、表达及免疫原性的研究

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锦鲤疱疹病毒病的研究进展

锦鲤疱疹病毒病的研究进展作者：吕大成来源：《吉林农业》2011年第09期我国是水产养殖大国，近30年来水产业发展尤为迅速，目前水产养殖产量已经超过捕捞产量，约占养殖业的70%以上。

但是，随着水产养殖业的迅速发展，一些水产疾病的爆发也越来越频繁。

据统计，至2002年全国水产病害达到185种，直接造成经济损失141亿元。

目前，水生动物疾病种类繁多，且发病时间延长、传播速度快，危害程度大，发病后死亡率高。

更严重的是已经有所控制的严重疾病有返强趋势，近年来，在吉林、辽宁等地区的网箱养殖发展迅速。

随着淡水养殖业的迅速发展，各种疾病造成的损失也迅速上升。

尤其是近年来发生的锦鲤疱疹病毒病，给鲤鱼养殖业带来了巨大的经济损失。

2007年，我国质检总局要求停止从日本和印尼进口锦鲤和鲤鱼，将锦鲤疱疹病毒作为必检项目。

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的锦鲤、鲤鱼及其普通变种发生鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性和高死亡率的疾病。

该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节，但目前有低温下发病的趋势。

该病具有高度传染性，发病率和死亡率均高达80%～100%。

在锦鲤和鲤鱼的国际贸易中，由于缺乏相关的检疫制度，促使了该病在世界范围内暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业带来了破坏性影响。

1.国内外流行现状自从锦鲤疱疹病毒病暴发以来，各个国家和地区几乎每年都发生。

2003年以来，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼发生暴发性疾病，死亡率高达80~90%，经PCR检测为KHV阳性；近两年来，KHV检测也均为阳性。

另外，有报道，近年来在菲律宾非法进入的锦鲤中检测到KHV。

2008年，中国台湾地区检测KHV阳性率为7%；据2010年鱼病统计结果显示，泰国也有KHV的发生。

锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发，给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易等造成了极大的经济损失，并引起了各国的高度重视，因此，各国家和地区应加强合作，严格控制KHV的发生与流行。

锦鲤疱疹病毒流行病学及诊断防治技术研究进展

ＤＡＮ病毒，有囊膜，与其同科的ＣＶＣ之间有免疫Ｈ、ＣＶ鱼苗腹胀大，呈球状漂浮于水面，下风处居多，病鱼失去游泳能力、肚皮朝上，肛门红肿，鳃完整但苍白色。死亡率３％０以上，用小手术剪解剖可见０￣４％肠内充满许多溶血性小气泡，内脏模糊不清与肠溶在
的感染谱较小，仅感染锦鲤、鲤鱼以及鲤鱼的普通
变种。
３传播途径．
ＫＶ自２０年在我国首次发现后，得以迅速传Ｈ０２
播，至今已遍布全国各地。ＫＶＨ被怀疑可以藉由被污染的水、网具、鱼池、鱼缸或工作人员来携带传播，但是有关此病是如何传播，以及是否有其他保毒者或传播媒介皆没有确切的了解。并且很多遭到
１ＫＶ的临床症状．Ｈ
起，腹腔内有淡红色液体。
２防治方法．
ห้องสมุดไป่ตู้
①排去１３水，加注新水保持水质清新。②每／老亩平均１米水深，用食盐４千克，化水均匀泼洒。③ 每立方米水体用亮剑（氟苯尼考）．２＋大蒜素０３００克．
本研究就该病毒的流行及检测技术等方面作一概述，以期为国内的流行病学调查及疾病监控提供
参考。
一
、
ＫＶ性Ｈ特
锦鲤疱疹病毒，又称为鲤鱼间质性肾炎及鳃坏
死性病毒（ａｐｉｔｒｔｔａｎｐｒｔＳａｄＣｒｎｅｓｉｉＩｅｈｉｉｎｇ１ｅｒｓＳｖｒｓＣＧ）该病毒为线形双股ｉ１ｎｃｏｉｉｕ，ＮＶ。

锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析

锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析摘要：为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息，从锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ株）获得ORF108基因，应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF108基因结构和功能。

结果显示，ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da。

KHV-CJ 株与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。

但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。

ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区。

该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高，预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因。

关键词：锦鲤疱疹病毒;ORF108基因;生物信息学分析基金项目：长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目（12XN35）中图分类号：S941.41文献标识码： A DOI编号：10.14025/ki.jlny.2015.22.043自从20世纪90年代末，锦鲤疱疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鲤鱼和观赏锦鲤上发现并报道[1-2]。

感染本病毒后病鱼聚集在进水口，身体出现白色斑块，皮肤呈现砂纸状纹理并变得粗糙。

病鱼出现鳃和眼睛凹陷坏死等症状。

引起本病的病原较早称锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。

有人根据其病理变化又称为鲤肾炎鳃坏死病毒。

2012年ICTV（国际病毒命名委员会）发布的第九次分类报告将本病毒命名为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。

本病毒隶属于疱疹病毒目（Herpesvirales）异样疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。

相关文献一般仍沿用锦鲤疱疹病毒这个名字。

锦鲤疱疹病毒病的研究进展

（ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｏｆｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｅａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｋｏｉｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｋｏｉｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｋｏｉｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
中国兽药杂志
２０１５，４９（５）：６２～６５／袁海延，等

锦鲤疱疹病毒病的流行特点、诊断及防治的研究进展

验及消杀处理，不可擅自用药[21]或转移运输。对病
毒进行攻毒，发现胆汁酸不仅能促进其生长，还
鱼的来源和销售情况进行溯源跟踪，开展流行病
能提高异育银鲫的抗病能力。随着研究的逐渐深
学调查，及早发现并切断传播路径，降低损失。
入，相信在不久的将来会有针对疱疹病毒病的抗
4.2
穿心莲的饲料的异育银鲫死亡率仅为 15%；何杰
毒饲料问世。
3.2
无害化处理
捞出死鱼和病危鱼，用生石灰处理后深埋。
4.3
加强养殖人员培训
目前，我国水产养殖行业多以家庭作坊式小
隔离消毒
锦鲤疱疹病毒还可存在于病鱼的分泌物中在
规模饲养为主，存在文化水平不高、饲养随意、
水中传播[22]，应注意对染病鱼池的隔离，不得将水外
对设施设备的投入较低等特点，很多养殖户在养
国是渔业大国，据 2020 年中国渔业统计年鉴数据
检测鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的三重 PCR 检测
2019 年全国淡水养殖总产量的 9.6%，因此对锦鲤
便捷地对该疫病进行确诊。
显示，2019 年我国鲤鱼养殖总产量约 289 万 t，占
方法，相信随着检测技术的进步，可以更快速、更
疱疹病毒病的防治研究非常重要，本文对目前研究
Abstract: Koi herpesvirus disease is an epidemic disease that is easy to invade Cyprinidae fish. It has the
characteristics of strong infectivity, rapid onset and high mortality. It was first found in the 1990s. At present, it has

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【期刊名称】《科学养鱼》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】2页(P54-55)【作者】于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文锦鲤疱疹病毒病（KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的一种非常严重的、法定的传染病。

它通过锦鲤、鲤鱼的贸易传播。

该病死亡率高达80%～100%。

被感染的鱼常见的临床症状为有白色斑，眼凹陷，脾脏和肾脏肿大，鳃部坏死。

CyHV-3在温度15～25℃易感染，可从死鱼的肾、鳃、脾、小肠、肝脏和大脑中分离，其基因组包含约29.5万个碱基对（kb），编码156个开放性阅读框。

目前还没有有效的药物和疫苗可以抑制锦鲤疱疹病毒的感染。

因此控制该病原的流行主要依靠检验、检疫和隔离等手段。

现在针对KHV检测方法的研究主要包括分子生物学技术和细胞培养法。

细胞培养法检测流程至少需要2周，敏感细胞系繁殖难度大、灵敏度低；分子生物学方法除OIE列举的PCR方法外，还先后建立了4种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的检测方法，我国的科研工作者也建立了两种荧光定量PCR检测方法。

不过分子生物学方法只能检测病毒核酸，不能直接检测活病毒，且容易产生DNA污染，导致检测结果呈假阳性。

免疫学技术作为一种可以检测到活病毒的技术，弥补了以上方法的不足。

该技术的研究需要以抗原和抗体为基础。

对于CyHV-3，目前已经有几项研究利用免疫化学技术的抗体对抗原亲和力。

在2005年Adkinson Oren和Hendrick成功用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CyHV-3，在最近的一项研究中，CyHV-3的多克隆抗体被用于检测目的病毒，研究表明该技术可能比其他传统PCR方法更敏感。

锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防思考

锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防思考作者：胡新念来源：《农业与技术》2015年第14期摘要：锦鲤是一种较为名贵的大型观赏鱼，来源于中国，兴旺于日本。

在近些年来，我国江苏十分昌盛，开始进行大规模的养殖，逐渐成为渔业发展重要经济增长点。

对渔业的生产内涵、产业链完善有重要作用。

本文分析锦鲤疱疹病毒鉴定和预防思考。

关键词：锦鲤；疱疹病毒；鉴定思考中图分类号：S943 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150733147前言锦鲤疱疹病毒主要由病毒感染引起，是一种普通的框镜鲤由病毒感染之后，具有高度传染性，一旦感染就会致死。

该病主要出现在春秋季节，水温为18～28℃之间，这水温是病毒流行最佳水温。

随着时间的推移，病毒在低温环境下蔓延的趋势加强。

KHV感染范围比较狭小，只会感染鲤鱼、锦鲤以及一些普通的鱼种。

同锦鲤鱼种类似，都喜欢在合适的水温下生长，也不会感染上疾病。

一些成鱼和幼鱼就会容易感染。

成鱼相对幼鱼而言，死亡率较高。

从2003年以来，我国东北地区的普通锦鲤感染病毒的概率越来越高，死亡率高达90%。

进行PCR检测发现KHV呈阳性。

KHVD病毒在我国锦鲤和匡锐鲫蔓延较为严重，导致我国经济损失。

1 病毒效价测定及动物感染试验1.1 毒价测定把病毒液进行稀释，稀释量为10倍之上，将其分别接种入96孔板下进行培养，获得锦鲤单层细胞，每个稀释度再进行8孔重复。

放置在22℃下进行培养，安置上阳性对照孔，对没有稀释的细胞毒以及阴性对照孔分析，记录下CPE，再使用Karber法计算出TCID50效价。

1.2 动物感染试使用的是体积较轻的健康锦鲤作为实验对象，数量为30条，在实验室里观察了28d，没有发现任何病症。

将病毒培养液注射到实验鱼体内，数量为20条，每一条注射量为1mL，水温维持在20～24℃之间。

另外，一组数量为10条的；锦鲤作为对照鱼，考试观察实验现象。

临床表现出，在有症状的鱼组中提取出了DNA病毒，进行PCR鉴定。

锦鲤疾病之疱疹病毒病治疗方案！

锦鲤疾病之疱疹病毒病治疗方案！
这是一种令锦鲤养殖业者闻之色变的“瘟疫”，近10年来，每年给世界锦鲤产业造成过亿元的损失。

《病原》鲤疱疹病毒( KHV)，一种DNA病毒。

《症状》体表有溃疡，皮肤黏膜被破坏而失去光泽，局部皮下充血，鳍膜不同程度糜烂，末梢鳍丝裸露，鳃组织局部坏死，常见鳃部有火柴头大小的脓样坏死物，眼球下凹。

一条病鱼往往不是全部症状都有。

感染疱疹病毒病的锦鲤幼鱼外观
《流行情况》世界各地都有发生，据说最早是在以色列发现的。

水温13～29度是发生条件，在这个温度范围以外，即使携带病毒的鱼体也不会出现症状。

在我国南方，发病季节是11月至次年5月。

进口的第一代日本锦鲤容易发生，“土炮”免疫力稍强。

《预防措施》秋季末开始，经常投喂清火类中草药拌的药饵。

有效的中草药是：板蓝根三黄散、大黄粉、四黄粉。

每1~2星期投喂一天。

疱疹病毒病鱼的鳃部
《治疗方法》
(1)将水温提高到30度，用聚维酮碘泼洒，使池水药物浓度达1克／米。

(2)投喂中草药药饵，连续一星期，同时鱼塘泼洒聚维酮碘，使池水药鬯急蠹薹物浓度达1克／米3，连续泼洒3天。

(3)用浓度为1 00克／米聚维酮碘浸泡患病鱼30秒，每天一次，连用3天。

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锦鲤疱疹病毒病（ＫＨＶＤ）是由锦鲤疱疹病毒
（ｋｏｉｈｅｐｅｒｓｖｉｒｕｓ，ＫＨＶ）引起的锦鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ
鲤鱼的国际贸易促进了该病在世界范围内的暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成了破坏性影响。
ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｈａｓｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｉｎａｂｏｕｔ２１ｄａｙｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｋｏｉｈｅｐｅｒｓｖｉｕｓ；ＯＲＦ１ｒ４６ｇｅｎｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
２０１５，４９（６）：１３ —１６／袁海延，等
中国兽药杂志
锦鲤疱疹病毒ＯＲＦ１４６基因的克隆、表达及免祥，王好，张瑞雪，马跃，王钊
（吉林农业大学，长春１３０１１８）
白的小鼠血液中可检测到ＫＨＶ的特异性抗体，２１ｄ左右抗体水平达到最大值，为研究有效预防锦鲤疱疹病毒（ＫＨＶ）的疫苗提供了参考数据。
［关键词］锦鲤疱疹病毒；ＯＲＦ１４６基因；原核表达；免疫原性
ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＫＨＶｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄｏｆｔｈｅｍｉｃｅｉｎｊｅｃｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｓｔｕｄｙａｖａｃｃｉｎｅｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｐｒｅｖｅｎｔｋｏｉｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ｋｏｉｈｅｐｅｒｓｖｉｕｓｒＯＲＦ１４６ｇｅｎｅｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＰＥＴ３２ａ—ＯＲＦ１４６ｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｍｉｃｅ，ａｎｄｓｅｕｍｒｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄａｙｓ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌｅｖｅｌｏｆｓｅｕｍｒｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ＯＲＦ１４６ＧｅｎｅｓｏｆＫｏｉＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ
ＹＵＮＨａｉ — ｙａｎ，ＹＵＨｕｉ，ＺＨＯＵＪｉｎｇ — ｘｉａｎｇ，ＷＡＮＧＨａｏ，ＺＨＡＮＧＲｕｉ — ｘｕｅ，ＭＡＹｕｅ，ＷＡＮＧＺｈａｏ
（ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
［收稿日期］２０１５ — ０３ — ３０［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－１２８０（２０１５）０６－００１３－０４［中图分类号］￥８５２．６５
［摘
要］以ＫＨＶ— ＣＪ株为模板克隆了锦鲤疱疹病毒ＯＲＦ１４６基因，并构建重组质粒ＰＥＴ３２ａ —
ＯＲＦ１４６，用ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ — ＰＡＧＥ检测获得含ｈｉｓ标签大小为５７．４ｋＤａ的蛋白条带。蛋白纯化浓缩后免疫小鼠，不同天数采血收集血清，用间接ＥＬＩＳＡ检测抗体水平。结果显示：注射表达蛋
ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｚｅｏｆ５７．４ｋＤａｂａｎｄｓ（ｃｏｎｔａｉｎｓｈｉｓｔａｇｓ）．Ｐｕｒｉｉｆｅｄａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｍｍｕｎｅｄ