高纤维素降解放线菌的筛选与功能鉴定
纤维素降解菌的分离与鉴定
培养基的配置和分装
纤维素琼脂培养基： • (NH4)2SO4 2 g , • MgSO4· 7g， • H2O 1g, • NaCl 1g, • CaCO3 2g, • 水 500mL ,
• 121 ℃ 灭菌20 min，倒平板后,盖上不平板大小一致的无菌滤纸
（注意：滤纸要用秲醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2％苏打水冲洗至中性，干热灭菌 后备用 ）。
环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定
生物技术班
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果与分析
实验目的 • 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 • 初步鉴定出菌株所属的类型
试验原理
• 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切 葡聚糖酶(Cl酶)，[来自真菌简称CBH，来自细菌简 称Cex)]和B．葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简 称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用 后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过β-1，4一糖苷 键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述 三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之 间的比例兲系等都会影响到纤维素酶的整体活力 。
分离
（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液秲释成101~10-7系列浓度。
（2）分别用秱液器精确地吸取各秲释菌液0.2 ~0.3 mL，对号 先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从 浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤秲释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 ℃ 培养箱中，倒置培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ一周。
初筛
以下各步骤均在无菌条件下进行。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玱璃珠的三角 瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了 再倒入土样。） （2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培 养基 )的三角瓶,在 28 ℃和 150 r/min下, 振荡培养 3~ 5 d后 秱取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继 续培养。
纤维素降解菌的筛选分析研究 环境工程专业
纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。
牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。
因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。
本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。
采用水解圈法和3，5-二硝基水杨酸（DNS）法进行菌株筛选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DH02、DC02，其中DH01为枯草芽孢杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽孢杆菌，纤维素酶活性次之；DC02为贝莱斯芽孢杆菌，纤维素酶活性低于前两者。
三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。
关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBiological composting is the main method for the utilization of solid waste resources in most farms. It has the advantages of low investment, high efficiency, and high efficiency in the reuse of organic solid waste. However, there are also some shortcomings in the composting process, such as long fermentation cycles and Odor, incomplete decomposition of cellulose and lignin, etc. Cow manure contains a large amount of undigested cellulose and hemicellulose, which are the key factors that affect the maturity of compost and determine the quality of the compost product. Therefore, selecting and adding appropriate composting fermentation inoculants and high-efficiency cellulose degrading inoculants in the cattle manure composting fermentation is an effective way to solve the problems of long composting cycle of livestock and poultry manure and low degradation rate. In this study, enrichment culture and pure culture methods were used to isolate cellulose-degrading bacteria from cow manure and analyze their degradation characteristics, in order to obtain some high-efficiency cellulose-degrading bacteria. Using hydrolysis circle method and 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method for strain screening and enzymatic characteristics research, combined with morphological methods for preliminary identification, molecular biological methods to identify its species, a total of Three strains with good degradation effects were named DH01, DH02, and DC02. Among them, DH01 is Bacillus subtilis with the highest cellulase activity; DH02 is Bacillus thuringiensis, followed by cellulase activity; DC02 is Bacillus velezs Bacillus,cellulase activity is lower than the former two. The three strains can decompose cellulose to different degrees, so they can provide strain ideas for cattle manure composting and fermentation, which has important application value.Key words: cellulolytic bacteria，Cellulase，isolation，enzymatic properties目录1. 引言 (1)2. 材料与方法 (2)2.1 试验材料 (2)2.1.1样品来源 (2)2.1.2培养基 (2)2.1.3供试溶液 (2)2.1.4供试仪器 (2)2.2 试验方法 (3)2.2.1纤维素降解菌的富集 (3)2.2.2纤维素降解菌的初筛 (3)2.2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定 ............................................................ 错误!未定义书签。
降解纤维素菌株的筛选
纤维素降解菌的分离和筛选1.实验目的：1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选的方法2.学会会培养基的制备3.再次了解菌落的形态2.实验原理：从美术楼后面树林中取适量的土壤，用无菌水将得到的样品经适当稀释, 在37℃下培养1d后，稀释10-6、10-7、10-8三个浓度，分别接种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。
最后镜检。
3.试验方法：1. 取样先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。
用灭菌的塑料袋盛装。
2．饥饿培养秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，在37℃下培养1d。
3.梯度稀释所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。
用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-610-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。
4.选择培养○1刚果红培养基的制备所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、200ml培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
灭菌后，倒9个灭菌平板，凝固后待用。
○2涂布平板将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-8 3种稀释度（每个稀释度划3个平板）。
然后用移液管分别由10-6、10-7,10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，菌落周围将会出现透明圈。
○3菌落形态观察菌圈直径（0.3~0.6cm）○4划线分离PDA待凝固后，从以上涂布的9个平板当中取出1个菌落周围的透明圈比较大的平板。
堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定
堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定作者：李丹花，乔莉娟，岳丹，等来源：《湖北农业科学》 2015年第16期李丹花，乔莉娟，岳丹，昝立峰，段保宁，白兰所（邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸０５６００５）摘要：从邯郸地区堆肥中分离出５株具有纤维素降解能力的菌株，纤维素降解能力的初步鉴定结果显示，Ｍ１菌株具有较强的纤维素降解能力。
对Ｍ１菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定，结果表明，Ｍ１菌株应当归属于假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．），菌株的温度生长范围为１０～４５°Ｃ，最适生长温度为３０°Ｃ，ｐＨ６～８菌株均可生长，最适条件为ｐＨ６。
关键词：土著菌；纤维素降解；假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）；生长特性中图分类号：Ｘ７０５文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）16－3884-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.16.013收稿日期：２０１５－０５－１４基金项目：邯郸市科技计划项目（１３２２１０１０６５－４）；邯郸学院校内委托项目（１４３０１）作者简介：李丹花（１９８２－），女，河南平顶山人，讲师，博士，主要从事微生物学研究，（电话）186********（电子信箱）ｙｄ＿ｌｄｈ＠１６３．ｃｏｍ。
当前，农村环境污染日趋严重，尤其是农村生活垃圾、畜禽养殖废弃物及农作物秸秆等主要农村固体废弃物已成为污染农村环境的主要因素，影响着农村建设的进程。
堆肥化处理技术是解决农村固体废弃物问题的一个重要途径，是目前使废弃物无害化、减量化和资源化的关键技术［１］。
在高纤维含量的堆肥或者添加秸秆、木屑等调节剂［２］的堆肥处理中，其成分和结构复杂，难以被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用，已成为缩短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素，因此，纤维素的生物降解成为堆肥技术处理有机固体废弃物的关键，一些研究者就堆肥纤维素分解菌进行了研究，筛选出很多高效的降解菌株［３，４］。
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。
随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。
利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。
二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。
三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。
研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。
纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。
1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。
2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。
3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。
4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。
5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。
6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。
通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。
一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果
ｃｎｉｏｓｏ ０ｒｒｎａ２ ｅｒｅ Ｃ ｈ ｅｐａ ａ ｅ ｏ ｄｇ ｃｎｓ Ｅ ／ ｅ ） ｅｏｌｃｎ ｅ（ Ｂ ／ ｅ ）ａｄＢ ｏｄｔ ｎ ｆ ２ ａ ８ｄｇ ｓ ．Ｔ ｅｋ ｌ ｓ ｆ ｎ ｏｌ ａａｅ（ Ｇ Ｃ ｎ ， ｘｇｕａａ Ｃ Ｈ Ｃ ｘ ｎ ． ｉ １ ／ｉ ｔ ｅ ｖｕ ｅ ｕ ｓ
基。 １ ）全国优 秀博 士学位论文专项 基金 （０５４ ； ２０４ ） 黑龙江 省杰出青
年基金 （Ｃ ０ ９ ９ 。 Ｊ ２０ ０ ） 第 一作者简介 ： 李保 深 ， ，９５年 ２月 生 ， 男 １８ 东北 林业 大学林 学 院， 硕士研究生 。 通信作 者 ： 高大文 ， 东北林 业大学林 学院 ， 授。Ｅ ｍ ｉ ｄｗｎ 教 — ａ ：ａｅ— ｌ
ｇ ｅ ｓ ａｅ（ ． ａｅ ｅ ． ５ ， ． ８ ｎ ． ８ ／ ｓ ｃ ｖ ｌ ｌ ｏｉ ｓ Ｂ Ｇ ｓ ）ｗ ｒ ３ ８ ６ ２ ６ １ａ ｄ １ ４ ７Ｉ ｍＬ ｒ ｐ ｔ ｅ ． ｙ ｄ ｅ Ｕ ｅｅ ｉ ｙ
Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｓ ｒ ｅ ｅ ａ ａｉ ｎ ｙ ｒｓ ｃ ｎ ｓ ｐ ｔ ：Ｐｅ ｉｉ ｉｍ ｅ ｕ ｅ ｓ；１ Ｓ ｒ ｅ ｒ ｏ ｎ ｃｌ ｕ ｄ ｃ ｍｂ ｎ ｌ ８ ＤＮＡ；Ｃ ｌ ｌ ｅ；Ｓ ａ ｎ ｎ ｌｃ ｒｎ ｍｉ ｒｓ ｏ ｅ ｅｌ ａ ｕｓ ｃ ｎ ｉ ｇ ｅ ｅ ｔｏ ｃｏ ｃ ｐ ｓ
ｇｏ ｇ ｉ． ｏ ｏ ａ ＠ ｍａｌ ｅｍ
１ 材料 与方 法
收稿 日 ： １ 期 ２ ０年 ｌ ２ ０ ２月 ９日。 责任编辑 ： 红 。 程
１２ 分析方法 。 将纯培养菌株接人发 酵培 养基 中 ， ２ 、 ０ ／ ｉ 摇 床 ８℃ １ ｍｎ ２ｒ 培养 ７ｄ 用 移 液 枪 吸取 １ｍ ， Ｌ发 酵 液 离 心 （ ０ ／ ｉ ， ９０ ０ ｒｍ ｎ ５ ｍｉ） 上清液即为粗 酶液 。 ｎ， 酶活力 的测 定 ： 滤 纸糖 化力 的测 定 。取粗 酶 液 ０ ５ ① ． ｍ ， Ｌ加入醋酸一醋 酸钠 缓冲液 （Ｈ 值 ４８０ １ ｏ Ｌ ２ｍ ， ｐ ． ，． ｍ ｌ ） Ｌ ／ 然后 加入一张（ ｘ ） １ ｍ ６ ｍ 新华 １ ｃ ｃ 号滤纸 ， ℃恒 温水浴 １ ５ ０ ｈ
高效纤维素降解菌的筛选[1]
![高效纤维素降解菌的筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/07e44f56312b3169a451a439.png)
mL - 1 mL - 1
X21 14
9
X22 16
11
X23 10
7பைடு நூலகம்
Z21 18
22
Z22 73
35
Z23 54
29
Z24 22
18
Z25 55
24
透明圈 直径
1. 1 1. 3 1. 0 1. 5 3. 4 2. 0 1. 5 1. 2
CM C 酶 FPA 透明圈 菌种 U · U · 直径
mL - 1 mL - 1
21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5
0. 000 0. 264 0. 427 0. 592 0. 754 0. 811 1. 112
DN S 法测糖。在上述条件下, 定义每分钟催化纤维素
水解生成 1 Λg 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U 。
滤纸酶活 (FPA ) 的测定 将新华 1 号滤纸 (1
2. 2. 1 GL C 标准曲线 用 DN S 法, 在波长为 520 nm 条件下, 测定一
系列已知样品, 制备标准 GL C 曲线, 制备过程见表 1, 绘制结果见图 2。
表 1 葡萄糖标准曲线测定结果
含糖总量 m g 葡萄糖液 mL 蒸馏水 mL DN S 试剂 mL 加热 冷却 蒸馏水 mL 光密度 O. D.
Keywords: Screen ing Cellu lo se2decom po sing M icroo rgan ism s
植物纤维素约占植物体干重的 33. 4%～ 50% , 是地球上最丰富的有机物质。但是, 由于纤维素中存 在许多高能的氢键, 因此其水解、利用均很困难。 世 界上平均每年约生成 1500～ 2000 亿 t 植物性有机 物, 其中约有一半为纤维素类物质, 仅能利用一小部 分。绝大部分都被弃置[1], 因此如何更有效地开发和 利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。 能够降解纤维素的微生物有很多, 可是目前的研究 却大多集中在有限的几个菌株上, 如康宁木霉、里氏 木霉等。然而这些菌株仍然存在着产酶成本高, 酶活 性不稳定, 作用 pH 范围狭窄等问题。 因此寻找更 多、更高效、作用范围更广泛的新菌种是十分必要 的。作者研究比较了几种纤维素降解菌筛选方法, 并 从自然界筛得高效纤维降解细菌 1 株, 真菌 3 株。该 细菌可在 4 d 内将滤纸平板完全降解为粘质, 初步 鉴定为嗜纤维菌属。 此外, 3 株真菌均为木霉菌, 降 解活性也很高, 其中一株在发酵培养第 6 d, 滤纸酶 活 (FPA ) 即可达到 51 U mL。