实验14-PCR技术
pcr实训报告
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PCR实训报告
PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA 片段。
在本次实训中，我们学习了PCR的原理和操作方法，并进行了一系列实验，以加深对PCR技术的理解。
实验一：PCR反应体系的构建
在实验一中，我们构建了PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTP、聚合酶、缓冲液和水。
通过反应体系的构建，我们了解了PCR反应体系中各个组分的作用，并掌握了反应体系的配制方法。
实验二：PCR扩增条件的优化
在实验二中，我们对PCR扩增条件进行了优化。
通过调整温度、引物浓度、模板浓度等参数，我们获得了最佳的PCR扩增效果，并得到了高品质的PCR产物。
在实验中，我们还学习了如何评估PCR 产物的质量和浓度。
实验三：PCR产物的检测和分析
在实验三中，我们对PCR产物进行了检测和分析。
通过凝胶电泳和文库测序技术，我们确定了PCR产物的大小和序列，并进行了序列比对和基因注释。
通过实验，我们深入了解了PCR产物的检测和分析方法，掌握了基本的生物信息学技能。
总结
通过本次实训，我们深入了解了PCR技术的原理和应用，掌握了PCR反应体系的构建和扩增条件的优化方法，学习了PCR产物的检测和分析技术。
本次实训为我们今后从事分子生物学研究奠定了基础，并为我们掌握更多高级技术和开展更深入的研究工作提供了重要的支持。
PCR技术原理与操作
PCR技术原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种常用于分子生物学研究和诊断的技术。
它通过扩增目标DNA片段，从而使其在实验室中具有足够的量进行进一步的分析。
以下将详细介绍PCR技术的原理与操作。
1. 变性（Denaturation）：DNA双链被高温（通常为94-98℃）瞬间加热，使其变性成两条单链DNA。
高温能够在较短时间内破坏氢键，使DNA分子完全解旋。
2. 引物结合（Annealing）：实验室中已知序列的两个DNA引物（小片段），分别与目标DNA序列的两侧配对结合。
温度被调至50-65℃，使引物与目标DNA片段发生特异性结合。
引物仅与目标序列互补配对。
3. 延伸（Extension/elongation）：在DNA引物的3'端，即目标DNA片段的其中一侧，加入DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，温度保持在65-75℃。
DNA聚合酶及其他反应物共同使目标DNA片段的核苷酸链延伸。
此步骤通常需要1-2分钟。
这三个步骤一起组成了PCR的一个循环，每个循环会使DNA扩增一倍。
通过让PCR循环重复进行，DNA的数量可以快速倍增。
PCR操作步骤：1.实验室准备：-收集所有PCR所需的试剂：模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液等。
-搭建一套无菌的实验室工作环境。
-定量测量所有试剂，确保使用正确的质量。
2.PCR反应混合物的制备：-准备PCR反应的混合物：一个典型的PCR反应液包含模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和水。
确保混合物中每种试剂的浓度符合反应所需。
-所有混合物都应在无菌条件下操作，以防止外部DNA污染。
3.PCR反应条件设置：-设置PCR反应条件，包括变性、引物结合和延伸的温度和时间。
这些条件应根据目标DNA片段的特性来确定。
-通常，PCR反应以94-98℃开始进行变性，然后降低温度以便引物结合，最后使温度上升以使延伸发生。
pcr技术实验报告
pcr技术实验报告PCR技术实验报告引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA片段，从而使得微量的DNA得以扩增至足够多的量进行进一步的分析和研究。
本实验旨在通过PCR技术扩增目标DNA片段，验证其在实验条件下的可行性和准确性。
实验方法1. 样品准备：从细胞或组织中提取DNA，并进行纯化处理。
2. PCR反应体系的准备：按照所需的PCR反应体系配制反应液。
3. PCR扩增：将DNA模板加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应。
4. 扩增产物分析：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
实验结果通过PCR技术扩增，成功获得了目标DNA片段，并在琼脂糖凝胶电泳中观察到了明显的扩增产物条带。
实验结果表明PCR技术在实验条件下具有较高的可行性和准确性，能够快速、高效地扩增目标DNA片段。
讨论本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的分子生物学研究提供了可靠的技术支持。
同时，本实验还表明PCR技术在分子诊断、基因克隆等领域具有重要的应用前景。
结论通过PCR技术实验，成功扩增了目标DNA片段，并验证了其在实验条件下的可行性和准确性。
PCR技术的高效、快速特点使其在分子生物学研究和临床诊断中具有广阔的应用前景。
总结PCR技术作为一种重要的分子生物学技术，已经成为现代生命科学研究中不可或缺的工具。
本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的研究和应用提供了可靠的技术支持。
PCR技术的不断发展和完善，将为生命科学领域的研究和临床诊断带来更多的可能性和机遇。
PCR技术及操作程序
PCR技术及操作程序PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，能够在短时间内快速复制特定的DNA片段。
PCR技术在基因检测、疾病诊断和生物学研究等领域得到广泛应用。
本文将介绍PCR技术的原理和操作程序，帮助读者更好地了解和应用该技术。
原理PCR技术主要依赖于DNA的复制过程。
它通过加热DNA使其解开双链结构，再利用特定的引物（即DNA片段的起始序列）使DNA复制酶能够在目标DNA的两个链上进行复制。
这样，每经过一轮PCR循环，目标DNA的数量便会指数级增加。
PCR技术一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA模板被加热至94-98°C，使其双链结构解开成两条单链。
在退火步骤中，温度被降至50-60°C，使引物与目标DNA序列互补结合。
在延伸步骤中，温度被升至72°C，该温度下复制酶（通常是Taq聚合酶）能够在引物的基础上将目标DNA序列进行复制，形成两条新的DNA链。
每经过一轮PCR循环，目标DNA的数量翻倍，经过多次循环后，可以获得大量的目标DNA。
操作程序进行PCR实验时，需要准备一些实验材料和设备，包括但不限于：•DNA模板：包含所需目标DNA序列的DNA样本。
•引物：与目标DNA序列互补的短DNA片段。
•脱氧核苷酸（dNTPs）：用于新的DNA链的合成。
•PCR缓冲液：提供适宜的pH和离子浓度，保证PCR反应的顺利进行。
•DNA聚合酶：通常使用Taq聚合酶，能在高温下工作。
•热循环仪：用于自动控制PCR反应中温度的变化。
•离心机：用于提取和处理PCR反应产物。
以下是一般的PCR操作程序：1.准备PCR反应体系。
按照实验所需的体系比例，将DNA模板、引物、dNTPs、PCR缓冲液和DNA聚合酶混合均匀。
确保反应体系中所有成分都能够达到所需浓度。
2.充分混合反应体系。
轻轻扎倒或短暂离心，将反应体系混合均匀，避免产生空气泡。
3.将反应体系分装到PCR试管中。
PCR的实验步骤
PCR的实验步骤PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种用于复制DNA片段的分子生物学技术。
它能够在体外迅速扩增特定的DNA序列，从而产生大量的目标DNA。
PCR技术包括三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
1.设计引物PCR的第一步是设计引物。
引物是短的DNA片段，能够与目标DNA序列的两个相邻区域配对，并为DNA聚合酶提供一个起始点。
引物在PCR中起到了不可或缺的作用，因为它们决定了所扩增的DNA片段的大小和序列。
2.变性PCR的第二步是变性。
在这一步中，反应混合物的温度被升高到94-98摄氏度，以使被扩增DNA序列的双链结构解开，变为单链的模板DNA。
这一步通常需要较高的温度，以确保DNA的完全解链。
3.退火在变性后，引物从溶液中结合到目标DNA的同系列上。
PCR反应混合物的温度会被降低到50-65摄氏度，以使引物与模板DNA结合。
引物必须在此温度下结合到模板DNA，以便聚合酶能够开始复制DNA。
4.延伸延伸是PCR的最后一步。
在此步骤中，反应混合物的温度被升高到72摄氏度，以使DNA聚合酶能够在引物的引导下合成目标DNA的新链。
该温度是DNA聚合酶的最佳活动温度。
在每个PCR周期中，DNA聚合酶通过将新的核苷酸加入到模板DNA上的3'-OH端开始复制。
此过程持续进行，直到达到所需的扩增循环数。
5.循环PCR通常会进行多个循环，以便在每个循环中复制和产生更多的DNA。
每个PCR循环包括变性、退火和延伸的完整步骤。
每个PCR周期的循环数取决于所需的DNA扩增量。
6.结束一旦PCR循环完成，PCR反应混合物中将会生成大量的目标DNA。
最后，反应混合物被冷却到4摄氏度，以停止任何酶活性的进一步延伸。
总结：PCR是一种能够快速扩增目标DNA序列的技术。
它通过变性、退火和延伸的循环步骤，能够在体外复制DNA片段。
设计合适的引物是PCR成功的关键。
PCR技术广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪科学等领域，对科学研究和医学诊断都具有重要意义。
pcr技术原理实验步骤和应用过程
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
PCR技术解析
PCR技术广泛应用于生物医 学、法医学、农业科学等领 域，如疾病诊断、遗传病筛 查、基因克隆等，是现代分 子生物学研究的重要工具CR的引物设计
PCR的变性过程
PCR的延伸阶段
引物是PCR反应的关键，它 需要根据目标DNA序列设计 ，长度一般为18-30个核苷酸 ，具有特异性和稳定性。
PCR技术的应用领域
2
进行的DNA复制过程，能够迅速扩增特定的DNA
PCR技术广泛应用于生物医学、法医学、分子生
片段。
物学等领域，如基因克隆、突变检测、疾病诊断
等。 3 PCR技术的操作步骤
PCR技术主要包括变性、退火和延伸三个步骤，
通过反复进行这三个步骤，可以实现DNA的高效
扩增。
02 PCR的工作原理
变性是PCR的首要步骤，通 过高温使双链DNA分离成单 链，为后续的复性、延伸创 造条件。
延伸阶段在适宜温度下进行 ，利用DNA聚合酶将新合成 的DNA链延长，实现目标 DNA片段的复制。
04 PCR实验设备和材料
PCR实验设备和材料
1 PCR实验设备介绍
PCR实验设备主要包括热循环仪、PCR管和热盖
的使用需要操作者有一定的技能和经验。
05 PCR实验操作技巧
PCR实验操作技巧
PCR实验前的准备
在PCR实验开始之前，需要 准备充足的试剂和设备，确 保所有物品的质量和纯度， 同时对实验室环境进行消毒 处理。
PCR反应条件的优化
通过调整PCR反应的温度、 时间和循环次数等条件，可 以有效提高PCR的特异性和 灵敏度，从而获得更准确的 实验结果。
PCR技术在疾病诊断 中的作用
PCR技术可以用于检测病原 微生物的DNA或RNA，从而 实现疾病的早期诊断和预防 。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤PCR技术原理及步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种分子生物学技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增出足够多的DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术之一。
本文将介绍PCR技术的原理及步骤。
一、PCR技术原理。
PCR技术是通过DNA聚合酶（DNA polymerase）在一系列温度循环中，不断地复制DNA片段，从而实现DNA的扩增。
其基本原理如下：1. 双链DNA解旋，首先将DNA样本加热至94-98°C，使双链DNA解旋成两条单链DNA。
2. 引物结合，将温度降低至50-65°C，引物（primers）与单链DNA互相结合，为DNA聚合酶提供复制的起点。
3. DNA聚合，将温度升高至72°C，DNA聚合酶开始复制DNA片段，合成新的DNA链。
通过这样的温度循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
二、PCR技术步骤。
1. 样本处理，首先需要从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2. 引物设计，根据目标DNA序列设计引物，引物的选择对PCR扩增的效果至关重要。
3. PCR反应体系配置，配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等成分。
4. PCR扩增，将反应体系置于PCR仪中，进行一系列温度循环，完成DNA的扩增。
5. PCR产物分析，通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析，验证扩增效果。
三、PCR技术应用。
PCR技术在分子生物学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用。
例如，可以用于基因克隆、基因突变分析、病原微生物检测等。
总之，PCR技术作为一种快速、高效的DNA扩增技术，已经成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具之一。
掌握PCR技术的原理及步骤，对于开展相关实验和研究具有重要的意义。
以上就是关于PCR技术原理及步骤的介绍，希望对您有所帮助。
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（五）结果的重现性差
1、原因 反应体系发生了变化 2、解决办法 用荧光定量PCR仪熔点曲线功能分析PCR的结果， 看非特异性产物和引物二聚物
九、常规PCR技术及几类PCR新技术
温度梯度PCR 热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 荧光定量PCR 兼并引物PCR 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异 PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 巢氏PC 反向PCR
2、不具有校正功能的 （无3’ →5’核酸酶活性）
比如：一般的Taq DNA聚合酶
（二）模板
核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否 的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标 本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原 体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直 接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸 胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
（四）dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关 系。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会 降低PCR产物的产量。
（五）PCR反应缓冲液
PCR反应过程示意图
变性
变性（94度）
引物
退火
退火（55度）
引物
延伸（72度）
DNA聚合酶 dNTP
经25~30次循环， 目的DNA增加106-9
三、PCR的反应动力学
Y = Y0 *
Y: Y0: X： n: 扩增拷贝数量 起始模板数量 扩增效率 扩增循环数
n (1+X)
PCR 理论方程
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量 呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但 在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期， 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物 的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效 应”，这种效应称平台期。
48°C
Optimized Annealing Temperature 62.6°C
（二）热启动PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的 最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。 因此，在PCR反应试剂配制过程中，以及在热循环 刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性 的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效 扩增。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上 配制PCR反应液，并将其臵于预热的PCR仪。这种方 法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并 不能完全消除非特异性产物的扩增。
PCR技术
一、聚合酶链式反应（PCR）概述
（一）概念
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技术，是近年来发 展起来的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法。
（二）发展历程
1971年
1983年 1987年 1993年
Kjell Kleppe提出PCR原始雏形 概念 Kary Mullis发明PCR技术 获得专利 诺贝尔化学奖
七、防止PCR错误扩增的措施
1、隔离操作、戴不受污染的手套 2、试剂的配制、分装和保存 3、开盖前先离心，小心开盖和上盖。 4、加样时最后加模板DNA 5、设立对照实验 6、注意其他操作过程中可能造成的污染
八、PCR常见问题及解决办法
（一）扩增不出特异性带
1、原因 （1）引物设计有问题（引物位臵错误，引物之间 太强的相互作用） （2）反应体系有问题 （3）退火温度太高 2、解决办法 （1）确认引物正确性 （2）用保证能扩增出来的引物验证反应体系 （3）采用梯度PCR功能，寻找最适合的退火温度
2、退火(复性)温度与时间
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组 成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温 度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大 大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应 的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物 与模板之间完全结合。
（二） PCR反应的循环次数控制
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数 主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数 选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性 产物的量亦随之增多。
六、PCR反应的特点
1、特异性强 PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的 结合、碱基配对原则、TqDNA聚合酶合成反应的正确度、靶基 因的特异性与保守性。 2、灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的。 3、简便快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液 加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反 应，一般在2～4h完成扩增反应。 4、对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总DNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗 嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
四、PCR反应体系的主要成分和作用
DNA聚合酶 模板 引物 dNTP 缓冲体系
（一）DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌的重组体， 与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活 性。
可分为两大类： 1、具有校正功能的（有3’→5’核酸酶活性）
比如：Vent,pfu,pwo等
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的 最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足 以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全 变性，就会导致PCR失败。
3、延伸温度与时间：
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之 间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于 引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的 长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间 1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩 增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非 特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增， 延伸时间要稍长些。
1、原因 （1）退火温度太低 （2）反应体系有问题 2、解决办法 （1）采用梯度PCR功能寻找最佳反应温度 （2）更换反应体系
（四）引物二聚物太多
1、原因 （1）引物设计有问题 （2）反应体系有问题 （3）退火温度太低 2、解决办法 （1）重新设计引物 （2）调整和更换反应体系 （3）用梯度PCR寻找最佳的退火温度
5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱 基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对 而导致PCR失败。 6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的 靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或 分子克隆很有好处。 7、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性。引物量以最低引物量产生所需要的结果为 好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增， 且可增加引物之间形成二聚体的机会。
二、PCR反应的原理和步骤
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制 过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤 构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃ 左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
（二）扩增带很弱
1、原因 （1）反应体系效率低 （2）退火温度太高 （3）很多非特异性扩增 （4）大量引物二聚物的形成 2、解决办法 （1）用已确认的引物验证 （2）采用梯度PCR功能寻最适的退火温度 （3）采用定量PCR的熔点曲线功能分析，提高退火 温度，改变反应体系的PH值
（三）非特异性扩增带很多
温度梯度PCR优化复性温度
Unoptimized Annealing temperature 50°C
Gradient optimization of 12 different temperatures across the block, tested between 48°C and 68°C
68°C
手动热启动法
管底：DNA、预冷buffer、dNTP和dH2O
管壁：引物
预热：80℃
加Taq酶，离心，开始PCR循环。
专用热启动酶法
抗体介导的抑制DNA聚合酶法 化学阻断DNA聚合酶法 其他DNA聚合酶抑制剂法
（三）Touch-down PCR
1、概念： Touch-down PCR又称降落PCR。即选定一个 温度范围，如50-35℃，每降1-2℃进行1-2个循 环，然后在50度下进行15个循环。 2、原理： 随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但 特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度 远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低， 特异性条带优先被扩增。
3、选择初始复性温度的原则：
起始复性温度应该比引物的Tm值高出 5-10度，然后每个循环递减1-2度。
4、Touch-down PCR的应用范围 模板DNA浓度较低; 引物简并程度高或特异性低; RT-PCR时使用oligo-dT。
（四）RT-PCR