第四章 动物细胞融合
动物细胞融合
思考题
★制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细 胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？ ★假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用它 来解决什么问题？
细胞融合后培养液中有几种细胞？ 细胞融合后培养液中有几种细胞？ B BB B瘤 瘤瘤 瘤 瘤 筛选杂种细胞 已知细胞合成DNA有 已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途 DNA 两条途径，其中D 径能被氨基嘌呤阻断。 氨基嘌呤阻断 径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两 DNA合成途径 但一般不分裂增殖。 合成途径， 条DNA合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓 瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖， 瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖， 将这两种细胞在试管中混合， PEG促融 促融， 将这两种细胞在试管中混合，加PEG促融，在 筛选培养基上筛选获得杂种细胞。 筛选培养基上筛选获得杂种细胞。
酶解法， 酶解法，如纤维素酶或果胶酶
2、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？ 、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？
无需， 无需，因为动物细胞无细胞壁
3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？ 、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？
离心、电激等物理方法；PEG等化学方法 离心、电激等物理方法； 等化学方法
幻 灯 片
二、单克隆抗体
3.单克隆抗体的应用：
①在基础理论研究中具有重要意义 ②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有 在疾病诊断、治疗和预防方面， 特异性高、灵敏度高等优越性。 特异性高、灵敏度高等优越性。 ③生物导弹
杂种细胞
一、动物细胞融合
1、动物融合的过程 请同学们阅读课本P52动物融合
1、动物细胞融合过程
不同DNA的两个细胞 不同DNA的两个细胞 DNA 灭活病毒诱导细胞融合
动物细胞融合实验实验报告
动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。
动物细胞融合与单克隆抗体 课件
胰蛋白酶或胶原蛋 白酶
物理法：离心、电激、 振动 化学法：聚乙二醇等 试剂诱导
除物理法和化学法 外，也可用灭活的 病毒诱导
过程
结果
杂种植株
杂交细胞
应用
培育植物新品种 主要用于制备单克隆抗体
意义
克服了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离， 扩展了杂交的亲本组合
1．关于动物细胞融合的说法，错误的是( ) A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动 物细胞结合形成一个细胞的过程 B．动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物 细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞 C．常用的诱导动物细胞融合的因素有：聚乙二醇、 灭活的病毒、电激、紫外线照射 D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远 缘杂交成为可能
2．融合的结果 形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的 遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。
3．植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
比较项目 原理 融合前 处理
使用的酶
诱导手段
植物体细胞杂交
细胞膜的流动性、细 胞的全能性
动物细胞融合
细胞膜的流动性、 细胞的增殖
先除去细胞壁
先使细胞分散开
纤维素酶和果胶酶
从小鼠体内提取的B淋巴 细胞有很多种，形成的 杂交瘤细胞也有很多种
筛选 方法
筛选 目的
用特定的选择培养基筛 选：未融合的细胞和同 种细胞融合后形成的细 胞都会死亡，只有融合 的杂交瘤细胞才能生长
得到杂交瘤细胞
用多孔培养皿培养，在 每个孔只有一个杂交瘤 细胞的情况下开始克隆 化培养和抗体检测，经 多次筛选得到能产生特 异性抗体的细胞群
答案：(1)Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 特异性强、 灵敏度高 (2)流动性 3 (3)杂交瘤细胞 能产 生所需抗体的杂交瘤细胞 选择性 (4)单克隆 抗体上连接抗癌药物 不损伤正常细胞，且用药 剂量少，毒副作用小 (5)动物细胞融合 动物 细胞培养
细胞生物学实验报告——动物细胞融合
细胞生物学实验报告——动物细胞融合实验目的：通过动物细胞融合实验，研究细胞融合对细胞形态和功能的影响。
实验原理：动物细胞融合是将两个或多个不同细胞融合在一起，形成一个新的细胞。
这种细胞融合可以通过化学物质、电融合或病毒介导等方式实现。
在本实验中，我们将使用化学方法进行细胞融合。
实验材料：1.小鼠胚胎纤维化细胞2.小鼠癌细胞3.融合剂（聚乙二醇）4.培养基5.显微镜实验步骤：1.将小鼠胚胎纤维化细胞和小鼠癌细胞分别培养至对数生长期。
2.用PBS洗涤细胞，加入适量的融合剂（聚乙二醇）。
3.用无菌吸管轻轻吹气使细胞悬浮液均匀混合。
4.将细胞悬浮液转移至培养皿中，并继续培养在37°C的培养箱中。
5.观察细胞的变化，使用显微镜观察细胞形态和细胞数量的变化。
实验结果：经过细胞融合，观察到融合细胞表现出不同于原始细胞的形态特征。
例如，融合细胞可能会表现出更大的细胞体积、不规则的形状以及异常的细胞核形态。
此外，融合细胞通常比原始细胞更抵抗外界环境的压力，更能适应培养基中的低营养条件。
讨论与分析：细胞融合是一种重要的实验手段，用于探究细胞形态和功能的变化。
通过将不同类型的细胞融合在一起，可以观察到融合细胞的形态和功能发生的改变。
这些变化可能包括细胞体积的增加、细胞形态的改变以及细胞功能的增强等。
细胞融合实验不仅可以帮助我们了解细胞的组成和特性，还可以为研究癌细胞的形成和功能提供重要的线索。
在本实验中，我们选择了小鼠胚胎纤维化细胞和小鼠癌细胞进行融合实验。
由于癌细胞的特殊性质，融合后的细胞可能会表现出更强的生长能力和侵袭性，这有助于我们研究癌细胞的形成机制。
然而，需要注意的是，细胞融合对于细胞的形态和功能的影响是非特异性的。
这意味着融合细胞的形态和功能不仅取决于融合的细胞类型，还取决于融合过程中的其他因素，如融合剂的用量和融合时间等。
因此，在进行细胞融合实验时，需要进行严密的实验设计和控制，以确保观察到的变化是由细胞融合引起的，而不是其他因素导致的。
动物细胞融合实验报告
一、实验目的1. 理解动物细胞融合的基本原理和常用方法。
2. 掌握化学融合和电融合的基本操作步骤。
3. 观察动物细胞融合过程中的行为和变化。
4. 通过实验验证细胞融合技术的有效性。
二、实验原理细胞融合是指两个或两个以上的细胞在自发或诱导条件下，合并成为双核或多核细胞的过程。
动物细胞融合技术广泛应用于生物医学、细胞工程等领域。
目前，常见的诱导细胞融合的方法包括病毒诱导融合、化学融合、电融合等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 小鼠脾细胞- 小鼠骨髓瘤细胞- 聚乙二醇（PEG）- 灭活仙台病毒- 电融合仪- 液体培养基- 洗涤缓冲液- 倒置显微镜2. 实验仪器：- 倒置显微镜- 低温冰箱- 恒温培养箱- 超净工作台- 电子天平- 移液器四、实验步骤1. 细胞培养：将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞分别培养在含有10%胎牛血清的液体培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞收获：将培养至对数生长期的细胞用胰酶消化，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
3. 化学融合：- 将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合，加入适量PEG，充分混合后静置5分钟。
- 加入洗涤缓冲液，终止反应，洗涤细胞。
4. 电融合：- 将混合后的细胞放入电融合仪的电极槽中，设定电压和时间参数。
- 启动电融合仪，进行电融合实验。
5. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有10%胎牛血清的液体培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
6. 细胞观察：利用倒置显微镜观察融合细胞的形态和细胞核的变化。
五、实验结果与分析1. 在化学融合实验中，观察到部分细胞发生融合，形成双核或多核细胞。
2. 在电融合实验中，观察到部分细胞发生融合，形成双核或多核细胞。
3. 融合细胞的细胞核呈现明显的核仁，且核膜清晰。
六、实验结论本实验成功实现了小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，验证了细胞融合技术的有效性。
第四章 细胞融合及其应用
养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。
利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂
种细胞。
亲本A：色氨酸缺陷型
亲本B：苏氨酸缺陷型
杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上
培养，而亲本细胞均会死亡。
3、温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养 细胞能在 32 度到 40 度的范围内生长，但温度敏 感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此 筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在 37 度左右 生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。
添加促融合剂，可提高融合率。
3.2 动物细胞融合
亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容 易；表面光滑的不易融合； 细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴 细胞或血球细胞不易融合。 融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合， 37度、振荡。 需氧量大，缺氧常不融合。 需要Ca
样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞 ＋B细胞质和部分染色体或基因。
2、基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部 分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合， 其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移 通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于 基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。
• 该方法异核体形成频率低，0.1-4%。
2.1.2 高钙-高pH法：
首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植 物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了 烟草体细胞杂种（1973年，50mmol/L钙离子、 pH值10.5）。
钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结 合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。
《动物细胞融合》课件
01
02
03
04
准备细胞
选择适当的动物细胞，进行培 养和传代。
诱导融合
根据所选择的诱导方法，将细 胞进行融合处理。
筛选融合细胞
通过特定的筛选方法，如克隆 形成或荧光激活细胞分选（ FACS），筛选出融合的细胞
。
培养与扩增
对筛选出的融合细胞进行培养 和扩增，以获得足够的细胞数
量。
动物细胞融合的注意事项
细胞兼容性
确保所选择的两种或多 种细胞具有相容性，以
便能够成功融合。
融合效率
了解并优化不同诱导方 法的融合效率，以提高
实验效果。
安全性
确保实验过程的安全性 ，避免对操作者和环境
造成危害。
法规遵循
遵守相关法律法规和伦 理规范，确保实验的合
法性和道德性。
03
CHAPTER
动物细胞融合的实验结果
融合细胞的形态学观察
融合方式
主要通过物理、化学或生物技术 手段实现，如电融合、聚乙二醇 （PEG）诱导融合、病毒诱导融 合等。
动物细胞融合的意义
生物医学研究
动物细胞融合可用于研究细胞生 长、分化、肿瘤形成等生物学过 程，有助于深入了解生命活动的
本质。
疾病治疗
动物细胞融合技术可用于制备单克 隆抗体、治疗某些遗传性疾病和免 疫缺陷疾病等，为疾病治疗提供新 的手段。
遗传性疾病治疗
动物细胞融合技术可用于治疗某些遗 传性疾病，如血红蛋白病、囊性纤维 化等。
02
CHAPTER
动物细胞融合技术
诱导动物细胞融合的方法
01
02
03
化学法
利用化学物质如聚乙二醇 （PEG）诱导细胞融合。
《动物细胞融合技术》 讲义
《动物细胞融合技术》讲义一、动物细胞融合技术的概念动物细胞融合技术，简单来说，就是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
这一技术在生物学和医学领域具有重要的意义和广泛的应用。
二、动物细胞融合技术的原理细胞融合的基本原理是细胞膜具有一定的流动性。
当两个或多个细胞靠近时，细胞膜会发生变形和融合，从而使细胞质和细胞核相互融合，形成一个新的杂种细胞。
在细胞融合过程中，通常需要使用一些诱导剂来促进融合的发生。
常见的诱导剂包括病毒（如仙台病毒）、化学物质（如聚乙二醇，PEG）和电刺激等。
这些诱导剂能够改变细胞膜的性质，增加细胞膜的通透性和流动性，从而促使细胞融合。
三、动物细胞融合技术的方法1、病毒诱导法仙台病毒是最早用于诱导动物细胞融合的病毒之一。
病毒的包膜上含有能够促进细胞融合的融合蛋白。
当病毒与细胞接触时，融合蛋白能够介导细胞膜的融合。
然而，由于病毒具有致病性和潜在的生物安全风险，目前这种方法的使用相对较少。
2、化学诱导法聚乙二醇（PEG）是目前应用最为广泛的化学诱导剂之一。
PEG 能够使细胞膜的磷脂双分子层结构发生紊乱，导致细胞膜的通透性增加，从而促进细胞融合。
具体操作时，将待融合的细胞混合在含有 PEG 的溶液中，经过一段时间的处理后，细胞就能够发生融合。
3、电融合法电融合法是通过在两个细胞之间施加短暂的高强度电场，使细胞膜发生穿孔和融合。
这种方法具有融合效率高、对细胞损伤小等优点，但设备要求较高。
四、动物细胞融合技术的应用1、单克隆抗体的制备单克隆抗体是由单个 B 淋巴细胞克隆形成的细胞群所产生的抗体。
通过动物细胞融合技术，将能够产生特定抗体的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体，从而实现了大规模生产单克隆抗体。
单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防等方面发挥着重要作用，如肿瘤的靶向治疗、自身免疫性疾病的治疗等。
2、细胞工程药物的生产利用动物细胞融合技术，可以将具有特定功能的细胞融合在一起，构建能够高效生产药物的工程细胞。
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小结：几种融合方法的比较
• 病毒融合的特点： ①需培养大量病毒，若灭活不充分，可能感染操作者。 ②操作复杂，融合率比较低, 可重复性不够高。 • PEG诱导细胞融合的特点： ①容易制备和控制，活性稳定，使用方便，融合能力强 ②有毒，易损伤细胞
• 电融合的特点 ①融合频率高，操作简便快捷，重复性强，对细胞伤害小 ②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞 ③非特异性融合
• 2、半固体培养法
• 3、单细胞显微操作法 • 4、流式细胞分选法
第三节 动物细胞融合技术的应用
• 一、生产单克隆抗体
• 二、基因定位和绘制人类基因图谱 • 三、肿瘤免疫和致瘤性分析
• 四、细胞核移植技术
• 五、向细胞内引入大分子物质
本章作业思考
• 1、名词解释 体细胞杂交
有限稀释法
• 2、总结细胞融合的三种常用方法及特点。 • 3、简述HAT培养及筛选杂交瘤细胞的原理。
三、细胞融合的影响因素（p113）
• 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面 性质、亲本细胞的亲缘关系） • 2.融合条件（温度、pH值、氧气） • 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50— 100mmol/L）
四、融合细胞的筛选与克隆 （p111、p120）
• • • • • • 一、融合子的筛选 遗传互补筛选法：HAT筛选 营养缺陷型互补筛选法 药物抗性互补筛选法 生长特性筛选法 温度敏感筛选法
第四章 动物细胞融合
• 主要学习内容：
1.动物细胞融合的原理 2.动物细胞融合的方法 3.融合细胞的筛选
第一节 细胞融合的生物学基础
• 一、概念和目的 • 细胞融合：自然或人工条件下，两个或两个 的细胞合并形成单个细胞的过程。
• 目的：用于体细胞杂交，获得杂种优势。
细胞融合的一般过程
凝集
膜融合
质融合
续时间的直流高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接
触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。
电融合技术优点
①对细胞损伤小。
②融合效率高。
电融合技术缺点
• 最大的不利之处是 仪器的购置。 • 在融合大小不同的 细胞时存在问题。 • 在融合膜成分不同 的细胞时存在困难。
③融合方法快速脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
H
存活
死亡
二、融合细胞的鉴定
• 1.细胞学鉴定：染色体鉴定
• 2.生化分析：同工酶谱分析 • 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术
三、融合细胞的克隆化培养
• 1、有限稀释法
• 通过有限次数的稀释，使96孔细胞培养板中平均 每孔仅含一个细胞的操作方法。
例如：
1.先取1.0 ml 5×104ml细胞+4ml培养基稀释， 得1×104/ml. 2.取0.5ml 1×104ml细胞液+4.5ml培养基稀释， 得1×103/ml. 3.取1.0ml 1×103ml细胞液+9.0ml培养基稀释， 得1×102/ml.
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
外源性途径(旁路途径)
DNA
T
胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase)
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+
骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
胞毒性和粘度也随之增大。
• PEG的处理时间:时间较短，一般1-10分钟
PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操作 简单，诱导率较高，是目前最常用方法。
3．电融合法：
电融合技术的原理：
悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中 的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的非均匀 交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子， 而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持
核融合
二、融合方法 1.病毒诱导融合：
灭活的 病毒既保留 了诱导细胞 融合的能力， 又不会感染 细胞。
使用仙台病毒诱导细胞融合步骤
1. 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心
2. 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液， 置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 3. 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使其 进行融合 4. 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性 培养基进行培养。
2．化学诱导融合
它们主要包括聚乙二醇（PEG）、二
甲基亚砜（DMSO）、甘油、醋酸酯、油
酸盐、脂质、钙离子配合物等。
其中则以PEG的使用最为广泛。
PEG诱导细胞融合的效果：
• PEG分子量大小:1000－6000,常用4000。
• 浓度:30－60％，常用50%。
• PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细