双水相萃取法
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
实验五 双水相萃取及分配系数的测定
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
第6章、溶剂萃取、双水相萃取和超临界萃取法
式中[A有]——物质A在有机相中的平衡浓度 [A水]——物质A在水相中的平衡浓度。
严格地说，只有当溶剂A在水溶液中的浓度极 低，并在两相中的分子型体相同时，KD在一 定温度下才是常数。而与溶质在整个体系中 的总浓度无关。但在分析实践中，溶质在溶 液中的浓度往往相当大，因此(1)式常发生偏 高，在此情况下，分配系数应以溶质A在两相 中的活度之比PA表示：
第六章 溶剂萃取、双水相萃取和超临界萃取法
基本原理； 溶剂；无机萃取体系的分类； 萃取条件的选择； 萃取分离操作； 逆流萃取；双水相萃取；超临界萃取；固相微萃 取(SPME)技术；反胶束萃取；凝胶萃取。 重点：溶剂、萃取条件的选择和超临界萃取、固 相微萃取技术。
§1. 基本原理
萃取过程的本质
无机盐类溶于水中并发生离解时。便形成水合离子。 如Al(H2O) 63+、Zn(H2O) 42+ 、 Fe(H2O)4Cl4-等，它们易溶于水而难溶于有机溶剂。 这种性质称为亲水性。许多有机化合物(油脂、萘、 蒽等)难溶于水而易溶于有机溶剂，这种性质称为疏 水性。如果要从水溶液中将某些无机离子萃取至有 机溶剂中，必须设法将其亲水性转化为疏水性。因 此萃取过程的本质，是将物质由亲水性转化为疏水 性的过程，其起作用的是萃取剂反应基团的活性。
式中[A]有和[A]水分别代表溶质A在有机相 和水相中的不同化学型体的总浓度。
三、分离系数(分离因数)
在同一体系中有两种溶质A和B，它们的萃取常数分别的为DA 和DB，这两个数的比值称为分离系数(β)
β=l，即DA = DB ，表明A和B不能分离。
β>l，即DA > DB ，表明A和B可分离，而β值越大，分离效 果越好。
新型分离技术-第四章 双水相萃取
在聚合物-盐或聚合物-聚合物系统混合物时，会出出
现两个不相混的水相，典型的例子如在水溶液的聚乙
二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran），当各种溶质均
在低浓度时，可以得到单项均质液体，但是，当溶质 的浓度增加时，溶液会变得混浊，在静止的条件下， 会形成两个液层，实际上是两个不相混溶的液相达到 平衡，在这种系统中，上层富集了PEG，而下层富集
双水相萃取法与传统的分离方法(如盐析或有机溶
剂沉淀等)比较也有很大的优势(如表);
处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法, 设备需用量要少3～10倍; 乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模；
用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠
杆菌匀浆中提取β -半乳糖苷酶,β -半乳糖苷酶的
双水相系统由两种聚合物或一种
聚合物与无机盐水溶液组成，由
于聚合物之间或聚合物与盐之间
的不相容性，当聚合物或无机盐
浓度达到一定值时，就会分成不
互溶的两个水相，两相中水分所 占比例在85~95%范围，被萃 取物在两个水相之间分配。
双水相系统中两相密度和折射率差别较小、 相界面张力小、 相易分散，活性生物物质或 细胞不易失活。
第四章：新型萃取技术 Novel extraction techniques
第三部分 :双水相萃取
Two-aqueous phase extraction
双水相萃取技术(aqueous-two phase extraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技 术(Partion of two aqueous phase extraction) 。 两相为互不相溶的两水相， 组分在两相中溶解度不同而分离。
β－干扰素（β－IFN）的提取
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双水相萃取法的应用及研究进展
摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视，它与传统的萃取及其它分离技
术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。
本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。
同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。
关键词：双水相萃取分离纯化进展
一：方法
随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境
保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。
双水相萃取技术始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系。
双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一
物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。
二：讨论
双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。
因此，广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域。
然而有关双水相分配的基础研究还不够，工业化的一些关键问题还没有解决。
为此，有必要加强这方面的基础研究，解决大规模萃取生物活性物质的工艺条件和设备方面的问题，促进双水相萃取技术的不断发展。
影响双水相萃取的因素比较复杂，主要包括静电作用、疏水作用和界面张力等。
通过对各个因素的调节，可以极大地提高蛋白质的选择性，达到向一相富集的目的。
A 1}'帅的组分性质千差万别，从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无扫L 小分子到有扫L高分子甚至生物大分子，这些都不可避免地造成理论计算的复杂性，以至
于现在还没有一套比较完善的理论来衡量各个影响因素之问的关系和解释生物大分子在体
系中的分配扫L理.有关A丁PS分配模型的研究中，较为成功的有的渗透维里模型，以及晶格模型。
前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度;后者在粒子的能
量概念上很好地拟合了实验数据，得出蛋白质分配的基本驱动力。
蛋白质分配焙驱动力由两部分组成:一是蛋白质和其它组分格子的直接相互作用，另外，就是构成相的组分(溶质除外，比如蛋白质)由纯组分到混为一相所需的总的焙值，即相的“自身能量”。
直接相互作用项为负值，则蛋白值更易分配到该相中，具有较高“自身能量”的相也使蛋白质更容易进入。
混合嫡也会促使蛋白质进行不平衡分配，在没有焙的影响卜，蛋白质更易分配到具有更高分子密度的相中等从寸展理论出发，用把相问电势表达为上卜相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法，提出了能对肤和蛋白质在非离子型聚合物/非离子型聚合物冰体系的分配系数很好关联的模型通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肤、蛋白质)的水化壳进行掐述的因子得到了改进的膜型，此模型很好地模拟了73种由组成的相平衡和分配系数.完善液液平衡理论，用掐述分配行为的因子来修正液液平衡理论的热力学模型，建立和完善双水相萃取机理的理论仍是研究的重点和难点。
新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系随着双水相技术研究的不断深入，新的双水相体系表而活性剂表而活性剂水体系、普通有机物无机盐水体系、双水相胶束体系等体系相继被发现。
三：结果
双水相萃取技术是近年来新发展起来的分离技术，所需设备简单、条件温和、易于操作，且可以获得较高的收率和较纯的有效成分，与常规的有机溶剂萃取技术相比较，最大的优势在于可保持生物物质的活性及构象，因此在生物工程、药物分析、环境科学等方面有着广阔的应用前景。
然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。
双水相萃取技术的发展趋势为:(1)解决易乳化、相分离时间长、成相聚合物的成本较高、水溶性高聚物粘度较大且不易定量控制等问题;(2)开发新型优质的双水相体系;(3)进一步拓宽应用领域;(4)与其它技术结合的多元化利用。
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