REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ｒｅｍｉ）技术介导的红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素b作为抗性筛选标记，ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１作为转化质粒，采用ｒｅｍｉ技术转化红曲霉。

结果表明，用ｒｅｍｉ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和ｐｃｂ１００３适合于红曲霉的转化。

环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ｒｅｍｉ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍｌ时，每微克质粒可获得的潮霉素ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ｈｉｎｄⅲ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μｌ时转化率最高。

关键词：红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（remi）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｈｐｈｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒａｎｄｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，ｐｃｂ１００３ａｎｄｐａｎ７－１ａｓｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓｍ．ａｎｋａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｂｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｙｒｅｍｉ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗｈｅｎｕｓｉｎｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏａｎｄｐｃｂ１００３ａｓｖｅｃｔｏｒｓ．ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｎｏｍａｔｔｅｒｉｆｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｏｒｎｏｔ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｄｕｃｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１×１０７～１×１０８ｍｌｗｅｒｅｆｉｔｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｍ．ａｎｋａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｗａｓ２８００～３２００ｉｎｄ．／μｇｖｅｃｔｏｒｄｎａ．ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｈｉｎｄｉｉｉａｎｄｖｅｃｔｏｒｄｏｓｅｗａｓ１０5～１２０ｕａｎｄ８μｇ／１００μｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐ．；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ）限制性内切酶介导的整合（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄｎａ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｒｅｍｉ）技术是将ｄｎａ转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种方法。

ｒｅｍｉ的非同源整合机理与非同源末端连接（ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ｎｈｅｊ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ｄｎａ的酶随线性化ｄｎａ进入核内；第二，限制性内切酶在特定识别位点酶切宿主染色体ｄｎａ；第三，染色体ｄｎａ和转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。

１９９１年ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ｒｅｍｉ技术应用于极易同源整合的ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。

ｋｕｓｐａ等［７］首先将ｒｅｍｉ技术应用于ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ｒｅｍｉ－ｒｆｌｐ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。

应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。

ｒｅｍｉ技术还成功应用于子囊菌ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ［１１］、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。

研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。

１材料与方法１．１材料１．１．１菌株、质粒与培养基菌株ｍ７５７７是野生型红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓａｎｋａ），由贵州大学真菌资源研究所分离、保存。

用于遗传转化的质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ由法国ｓｉｌａｒ教授惠赠，该质粒携带潮霉素ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ酶切线性化的。

质粒ｐａｎ７－１［１４］带有来自ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的启动子和ｔｒｐｃ基因［１５］的终止子。

用ｈｐｈⅰ酶切质粒ｐａｎ５２－１，用ｔ４ｄｎａ聚合酶补平末端，再用ｂａｍｈⅰ酶切得到１．１ｋｂｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影响酶功能的前３个密码子）［１６］，与ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ带有起始密码子ａｔｇ的ｇｐｄ基因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密码子区域与ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｔｒｐｃ基因末端区域的ｈｐｈⅰ－ｂａｍｈⅰ片段融合，克隆到质粒ｐａｎ５２－１（克隆前先用ｎｃｏⅰ酶切ｐａｎ５２－１，用ｔ４ｄｎａ聚合酶补平末端，再用ｂａｍｈｉ酶切）上构建得到ｐａｎ７－１。

质粒ｐｃｂ１００３带有来自ｐｃｓｎ４３［１７］的２．４ｋｂｓａｌⅰ片段（含有潮霉素ｂ抗性基因ｈｐｈ和来自ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐｃ启动子和终止子），通过单个碱基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４个限制性内切酶位点：ｅｃｏｒⅰ（ｇａｇｔｔｃ）、ｐｓｔⅰ（ｃｔｇｇａｇ）、ｓｓｔⅱ（ｃｃｇｃｇｃ）和ｂａｍｈｉ（ｇｇｔｔｃｃ），但ｈｐｈ基因编码的氨基酸序列未变。

通过ｐｃｒ技术消除ｔｒｐｃ终止子，获得了１．４ｋｂ的片段，并在片段两端引入ｅｃｏｒⅰ、ｓａｌⅰ和ｈｐａⅰ位点，最后通过ｅｃｏｒⅰ位点亚克隆到ｐｕｃ１９构建得到ｐｃｂ１００３。

菌丝生长的ｃｍ培养基和产孢培养基按文献［１８］配制，原生质体再生液体和固体培养基是分别于ｃｍ液体和琼脂糖固体培养基中加入蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／ｌ；复苏液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／ｌ。

１．１．２药品与试剂各种限制性内切酶和ｐｆｕｄｎａ聚合酶为ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、ｌｙｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ购于ｓｉｇｍａ公司，ｓｎａｉｌａｓｅ购于华美生物工程公司，琼脂糖购于ｂｉｏｗｅｓｔ公司，质粒中量制备试剂盒为德国ｑｉａｇｅｎ公司产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。

电击转化缓冲液ⅰ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、６００ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ，用于不含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液ⅱ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、６００ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ、３００ｇ／ｌ聚乙二醇４０００，用于含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液ⅲ含有１０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ７．５）、２７０ｍｍｏｌ／ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ｌｌｉａｃ，用于萌发孢子的电击转化。

ｓｔｃ溶液含有１ｍｏｌ／ｌ山梨醇、５０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ｌｃａｃｌ２，ｐｔｃ溶液含有４００ｇ／ｌ聚乙二醇４０００、５０ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃｌ（ｐｈ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ｌｃａｃｌ２。

１．２方法１．２．１原生质体的制备参考文献［19］。

菌株ｍ７５７７在产孢培养基上于３０℃培养７～１０ｄ，收集孢子并制备成均一的浓度为１×１０８～１×１０９个／ｍｌ的孢子悬液。

取２００μｌ孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的ｐｄａ平板上，于３０℃培养３０ｈ，收集菌丝体，用１ｍｏｌ／ｌｍｇｓｏ４溶液洗１次。

约３００ｍｇ菌丝体加３０ｍｌ裂解酶液，于３０℃以６０ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ｈ，过滤，滤液于４℃、以３２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。

弃上清，用１．２ｍｏｌ／ｌ预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀２次，分为２份。

一份重悬于１．２ｍｏｌ／ｌ预冷的山梨醇溶液中，一份用预冷的ｓｔｃ溶液洗１次。

两份样品均置于冰浴备用。

１．２．２质粒的线性化用ｈｉｎｄⅲ酶切线性化质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ。

酶切反应体系：３６μｌ１０×ｅｎｚｙｍｅｂｕｆｆｅｒ，２０μｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，１２μｌ１０ｕ／μｌｈｉｎｄⅲ，加ｄｄｈ２ｏ至３６０μｌ，置于３７℃水浴２～４ｈ，于６５℃水浴反应１５ｍｉｎ，停止反应，然后分为２份，一份备用，称为质粒ａ液；另一份用苯酚－氯仿抽提纯化，然后溶解于无菌去离子水，称为质粒ｂ液。

１．２．３ｒｅｍｉ技术的转化方法参考文献［20］。

用预冷的ｓｔｃ溶液洗原生质体并再重悬，浓度调整至５×１０７个／ｍｌ。

取１００μｌ转化用原生质体液，加入１μｇ环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，轻轻吹吸混匀；分别加限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ３０～１９０ｕ，冰浴３０ｍｉｎ，加１ｍｌｐｔｃ，于室温静置４０～６０ｍｉｎ，涂布于含有１２０μｇ／ｍｌ潮霉素ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００μｌ转化液。

于３０℃暗培养４～５ｄ，统计转化子数。

１．２．４最适质粒的选择采用３个启动子序列来源不同的环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１，用量为７５或１０５ｕ的限制性内切酶ｈｉｎｄⅲ、ｓａｃⅰ、ｂａｍｈⅰ，将１μｇ不同质粒和限制性内切酶分别加到１００μｌ５×１０７个／ｍｌ原生质体中，对红曲霉进行转化试验，以潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选适合转化红曲霉的质粒。

１．２．５最适限制性内切酶的选择选择７种不同的限制性内切酶为转化质粒，其中平末端酶有ｓｍａⅰ和ｈｐａⅰ，５′端突出末端酶有ｈｉｎｄⅲ、ｓａｌⅰ和ｅｃｏｒⅰ，３′端突出末端酶有ｋｐｎⅰ、ｓａｃⅰ，向１００μｌ５×１０６个／ｍｌ原生质体液中加入１μｇ线性或环状质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和７５ｕ限制性内切酶进行转化试验，以不加酶处理的作对照，以潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选合适的限制性内切酶。

１．２．６酶切缓冲液对转化的影响试验有７种试验方案，１００μｌ原生质体液中，①加质粒ａ液和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，②加质粒ｂ液、１０５ｕｈｉｎｄⅲ和10×酶切缓冲液，③加质粒ｂ液和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，④加环状质粒、１０５ｕｈｉｎｄⅲ和10×酶切缓冲液，⑤加环状质粒和１０５ｕｈｉｎｄⅲ，⑥加质粒ｂ液，⑦加环状质粒作为对照。