16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用
16s rrna报告解读
16s rrna报告解读摘要：1.16s rRNA简介2.16s rRNA报告解读方法3.报告结果分析与应用4.报告的局限性与未来发展方向正文：随着分子生物学技术的发展，16s rRNA报告已成为微生物学、生态学等领域的重要研究手段。
16s rRNA是细菌核糖体的一部分，具有种属特异性，可通过高通量测序技术对微生物群落进行定性和定量分析。
本文将介绍16s rRNA报告的解读方法、结果分析与应用，以及报告的局限性与未来发展方向。
一、16s rRNA简介16s rRNA存在于细菌细胞中，负责蛋白质生物合成。
由于不同细菌物种的16s rRNA序列存在差异，可通过测定该序列对微生物进行分类和鉴定。
目前，16s rRNA测序已成为微生物多样性研究的主要手段。
二、16s rRNA报告解读方法1.序列分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等处理，得到序列。
然后，通过序列之间的相似性分析，对微生物物种进行分类和鉴定。
2.生物信息学分析：基于序列数据，进行物种多样性、群落结构、代谢途径等分析。
常用的生物信息学工具包括MetaPhlAn、Kraken等。
3.统计分析：对生物信息学结果进行统计，评估样本间的差异性和相似性，为实验结果提供依据。
三、报告结果分析与应用1.物种多样性分析：通过统计不同物种的序列数量，评估样本中的微生物多样性。
2.群落结构分析：分析不同物种在样本中的相对丰度，揭示微生物群落的组成和变化。
3.功能基因分析：基于代谢途径和基因功能，分析微生物群落的代谢活性。
4.应用：16s rRNA报告可用于医学、环境、农业等领域的微生物学研究，为疾病诊断、环境保护、农业生产等提供科学依据。
四、报告的局限性与未来发展方向1.局限性：16s rRNA报告无法区分共生和病原微生物，且受样本制备和测序深度等因素影响。
2.未来发展方向：发展更高效的测序技术、生物信息学方法，以及整合多组学数据进行综合分析，提高报告的准确性和应用价值。
16SrRNA基因在医学微生物鉴定中的应用效果观察
［ ］ 雷正瑜．６ ｒ Ｎ １ １ＳＤ Ａ序列分析技术在微生物分 类鉴定 中的应用 ［ ］ 湖北 Ｊ． 生态工程职业技术学院学报 ，０ ６４（ ） ３— ． ２ ０ ， １ ： ７ ［ ］ Ｍｉ ｅ ｗ Ｉ ＯｓｎＫ，ｏａｏＪｅ ａ． ａｎ ｓｃ ｔｉ ｎ ｌ ｉａ ｓｎｆ ２ ｃ ｌ Ｃ， ｌ Ｌ ｚｎ ，ｔ Ｄｉ ｏｔ ｉｔ ａｄｃｉｃｌｉ ｉ ｈｏ ｅ １ ｇ ｉｕ ｌ ｙ ｎ ｇ － 从（ 上表中可以看出） 采用 １ Ｓ Ｎ ， ６ ｒ Ａ基 因检查诊 断支原体肺炎 较采用 Ｒ 血清学检查诊 断支原体肺炎在假 阳性率 、 敏度、 灵 耗时方面有明显的优势 ， Ｐ ＜ ．５ 比较差 异有统计学意义 。 Ｏ０ ，
标准。
【 关键词 】６ ｒ Ｎ １ＳＲ Ａ基 因； 医学微生物检 定； 效果评价 ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １０ ０：０ ３ ６ ／．ｓ ．０ ６—１５ ．０ １０ ．７ ｓ ９ ９２ １ ．８０ ９ 文章编号 ：０ ６—１５ （ ０ １ ０ ３ ９ １０ ９９ ２ １ ）一 ８— ５ ４—０ ２ １Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因序列检测技术的原理是 ： Ｒ 细菌染 色体上编码 ｒ Ｎ Ｒ Ａ的相 对 应 的 Ｄ Ａ序列存在于所有细 菌及衣 原体 、 克次体 、 Ｎ 立 支原体 、 旋体 、 线 螺 放 菌等原核生物的染色体基 因中 ， 不存在 于病毒 、 真菌等非 原核生 物体 内， 而 目前 ， 几乎所有病原 菌的 １ Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因测序均 已完成 ， Ｒ 这样 ， 使得采用基 因 序列图谱进行对比分 析测试 病原菌 的种 类成为 了可能 ， 过该技术 可 以准 通 确快速的鉴定细菌的种类 … 。 养、 免疫学和生化反应等方法 ， 这些检测方 法的检 测结果受 多种因索影响 ， 均存在特异性差、 耗时长 、 敏感 度低等问题 ， 以满 足临床 医学 检验的发展 难 要求 Ｌ． 。近年来 ， ２ ｊ Ｊ 随着聚合酶链式反应 （ Ｃ 技术的出现及核酸研究技术 Ｐ Ｒ） 的不断完善以及其它分子生 物学技术 的迅 速发展 ， 生了很多新 的细菌分 产 类鉴定 方法 ， 常见 的如 限制 性片段 长度多态 性分 析、 质粒 图谱 、 Ｎ ｒ Ａ基 因 Ｒ （ ｒ Ｎ ） 即 Ｄ— Ａ 指纹 图 、 Ｃ Ｐ Ｒ指纹 图、 ６ １ Ｓ核糖 体核 糖核 酸 （ｉ ｓ ａ Ｒ Ａ ｒｏ ｍ ｌ Ｎ 。 ｂｏ １资 料 与 方 法 ． ｒＮ 序列分析等＿ 。这些 技术均 基于对细 菌染色 体或染 色体外 的 Ｄ Ａ Ｒ Ａ） ４ Ｊ Ｎ １ １ 一般资料 ： ． 本组 ５ ４例患者 中 ， 男性 ２ ３例 ， 女性 ３ １例 ， 年龄 ２一ｌ 片段进行分析 ， １ 从分子遗传的角度对细菌进行分类鉴定 ， 从而使细菌分类更 岁， 平均年龄 ６ ２ ．３岁 。所有患者均进行血清学检查诊 断和 １ＳＲ Ａ基 因序 精确 、 ６ｒＮ 更科学。特别今年来出现的 １ＳＲ Ａ基因序列分 析技术 ， 以做到用 ６ｒＮ 可 列检测肺炎支原体。以上患者的临床表现主要有 ： 头痛、 发热伴有无力 和干 实验 研 究 来 研 究 证实 细 菌 进 化 与 否 ， 是 细 菌 分 类 史 上 的一 次 革 命 【ｊ 目 这 ５。 咳等。 前， 大多 数致病 菌 的 １ ＳＲ Ａ基 因序 列 已经被测 定 完成 ， 于 Ｐ Ｒ扩增 ６ ｒＮ 关 Ｃ １２ 检查方法 ： ． 分别对 ５ ４例患 者进行血清 血检查 诊断 和 １ＳＲ Ａ基 １ＳＲＮ ６ｒＮ ６ ｒ Ａ基因用 于细菌分类和鉴定 的研究越来越多ｔ］ ６。 因序列检查诊 断， 统计两种检查方法的假阳性率 、 灵敏 度、 检测耗时等指标 ， 肺炎支原体是一类能在无生命人 工培养基 中生 长、 繁殖 的最小 的原核 分析两种检测 方法在诊断肺炎支原体感 染时的优劣 。 型微生物 ， 曾被称 为胸膜炎微 生物（ ｌ ｒｐ ｅｍ ｎａ ｉｅｏｇｎｓ Ｐ Ｌ 。 ｐｅ ｏ ｎｕ ｏｉ —ｌ ｒａｉ ｕ ｋ ｍ， Ｐ ０） １２ １ 血清学检查诊断 ： 体感染肺 炎支原 体后 ， ．． 人 血清 中除了出现 特 临床 的上呼吸道感染 、 气管支气 管炎及非典 型肺炎经 常是 由肺炎支原 体感 异性抗体外还存在冷凝素 ， 患者的稀释血清 与 Ｏ型红细胞在 ４Ｃ ＂ 下可发生凝 染引起 。由于肺炎支原体感染 所致 的肺 炎患者临床表现 症状不典型， 需 集， 此为 Ｉ 型抗体 。以 Ｅ Ｉ ｇ Ｍ ＬＳ Ａ方法检 测患者 血清 中 Ｍ Ｐ—Ｉ ｇ Ｍ。以 Ｍ 要经过 １ Ｐ— ０～２ ｄ的潜伏期才 能表现 出来 ， ０ 临床 症状主要 为非特异性 的头痛 Ｉ ｇ Ｍ≥ｌ８ 和 （ ） 凝集 试验 ≥１３ ： ０ 或 冷 ： ２判断为有支原体感 染， 结合临床有发 和发热 ， 患者常常伴有无力和干 咳 ， 根据这些 临床 症状较难判断为肺炎支原 热、 头疼、 无力 、 干咳等症状判定为感染肺炎支原体 。 体感染 ， 因此临床 常被忽视而导致 严重 的并 发症 ， 因此 ， 利用实验 检查 就成 １２ ２ ６ ｒＮ ． ． １ Ｓ Ａ基因序列 检查 ： Ｒ 从鼻咽和 口腔采用拭子采 样进行 Ｐ Ｒ 为 了诊断肺炎支原体感染的主要依 据【 。近年来 ， Ｃ ８ Ｊ 对于肺 炎支原体感 染的 扩增 ， 引物取 自 肺炎支原体的 １ＳＲ Ａ， 照肺 炎支原体 的基 因序列进行对 流 行 病 学 特 征 、 病 机 制 、 子 生 物 学 检 测 方 法 的 研 究 报 道 较 多 。 目前 ， ６ ｒＮ 按 致 分 用 比分析 ， 符合肺炎支原体基因序列并 伴有发热 、 头疼 、 无力 、 咳等症状判定 于诊断支原体肺炎 的方法是取上呼吸道标本做 Ｐ Ｒ和急性期血 Ｉ 千 Ｃ ｓ Ｍ的复合 为感染肺炎支原体 。 测定 。但人们对于上呼吸道 ＭＰ携带者与急性 期肺炎上 呼吸道标本的 Ｐ Ｒ Ｃ １３ 统计学方法 ： ． 计量资料采用 ｔ 检验 ， 数资料采用 ｘ 检 验 ， 计 且以 Ｐ 阳性者较难区分， 且对于儿童诊 断 ＭＰ肺炎取材 的理想位置和方法还未明 而 ＜ ． ５为有统计学意义 。 ００ 确建立 。因此 ， 找到一种有效、 快速 、 期的支 原体肺 炎鉴定方法 就显 得尤 早
16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用
第39卷 第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218; [修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。
16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王 斌2(1 青岛市市立医院检验科,山东青岛 266011; 2 青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。
通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。
本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。
1 16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。
其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。
一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。
rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16SrRNA在医学微生物鉴定中的应用探讨_马章林
鉴定上的应用[J].重庆中草药研究,2010,22(1):29. [3] 周永运 , 许彦梅 , 崔志刚 , 等 . 肠球菌为主要菌群的腹泻标本的 16SrRNA与PFGE分析[J].中国人兽共患病学报,2010,26(3):205. [4] 郭世奎,王昆华.16SrRNA基因与结直肠癌患者肠道相关分子微 生态研究进展[J].云南医药,2010,22(2):211. [5] 张志明,孙海英,李建平.16SrRNA在医学微生物鉴定中的应用 [J].中国医学检验杂志,2008,22(6):170. [收稿日期：2011-02-22 编校：苏建东]
其中16srrna比真核生物的相应rrna略小16srrna及其基因在微生物鉴定中有重要作用由于细菌各种属间生理特征和生化特征相似单凭传统方法已无法准确的进行分类鉴定随着科技的发展现在已经能通过对细菌dna最常用的是16srrna基因的进行鉴定区分细菌资料与方法11一般资料
吉林医学2011年4月第32卷第12期
1 资料与方法
1.1 一般资料：选择洁净级小鼠 20 只，体重接近， 10 只空腹 20 h腹腔注射STZ，72 h后加强注射，以血糖值＞11 mmol/L为标 准作为样品组；10只作为对照组，以无菌方式采取新鲜粪便，进 行DNA提取。根据长双歧杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌和肠球菌 16SrDNA基因序列，设计相应菌属的引物。并对比PCR引物序列 的相应菌属特异性。将提取的DNA样品以PCR产物制备的标准曲 线进行分析。 1.2 统计学方法：PCR仪用系统内置软件处理后的定量结果。
16SrRNA in medical microbe application are discussed MA Zhang-lin1, TANG Shu-ming2, LOU Xu-bai1(1.Shenzhen baoan
16SrDNA在细菌鉴定中的应用
细菌基因组提取的主要方案包括： 1、水煮模板；
2、CTAB/NaCl 法；
3、盐析法
二、16S rDNA 的PCR扩增
1、PCR实验原理 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术， 是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技 术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个 特异的目的DNA序列的拷贝， PCR技术虽然问世仅数年时 间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生 物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检 测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广 泛的应用。
此法操作简便可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的dna序列的拷贝pcr技术虽然问世仅数年时但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域引起了生物技术发展的一次革命目前它在分子克隆目的基础检测遗传病的基因诊断法医学考古学等方面得到了广泛的应用
细菌16S rDNA技术在细菌鉴 定中的应用
主讲人：李新琼
一、细菌基因组的提取
PCR法的操作过程
Step 1: DNA热变性
Step 2: 引物退火
Step 3: 引物延伸
例如：艾伯特埃希菌16S rDNA扩增 引物为通用引物:27F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1429R: 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
三、琼脂糖凝胶电泳
四、DNA测序及比对
较之5S 和23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大 小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。 其序列包含10个可变区（variable region）和与之相 同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异， 且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
16SrRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用
收稿日期： ２００６－ ０５－ １２； 作者简介： 都立辉（ １９８１－ ） ， 男， 硕士研究生， 主要从事食品微生物 方面的研究； 基金项目： 国家“８６３ 计划”课题资助（ ２００２ＡＡ２４８０４１） 。
出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种 的 细 菌 进 行 分 类 鉴 定 。 但 较 其 它 方 法 而 言 ， １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列测定分析更适用于确定属及属以上分 类单位的亲缘关系。
表 １ 目前比较通用的几种 １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 基因 ＰＣＲ 扩增引物
引物
序列（ ５’－ ３’）
ｆＤ１
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ２
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ３
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ
２ １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 在乳酸菌鉴定方面的研究进 展
近年来 Ｔ Ｙａｍａｍｏｔｏ 等设计和合成出人肠道 区系中常见的双歧杆菌属 ５ 个种（ 两歧双歧杆菌、 青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双 歧杆菌） 的特异性的寡核苷酸探针， 它们具有 １６￣
１９ 个碱基长度， 并与这 ５ 个种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列 互补。用天然高分子量的 ＲＮＡ 制备物作为靶子， 这些寡核苷酸探针对于人肠道中这些种的菌株具 有高度的种特异性， 结果表明用此法检测这 ５ 个 种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列能取得所期望的结果， 并且 整个试验过程从获得纯细胞物后只需 ６ｈ 可完成。
16s rdna序列 16s rrna基因序列
16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，是通过测定16s rDNA基因所编码的16s rRNA的序列而得到的。
在分子生物学和微生物学领域，16s rDNA序列被广泛应用于微生物分类、微生物多样性研究和微生物系统进化研究中。
本文将从以下几个方面对16s rDNA 序列进行介绍和分析。
一、成因和结构16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，它是细菌和古细菌核糖体小亚基rRNA基因的一部分，通常有约1500个核苷酸碱基对，可由16s rRNA基因编码。
这一序列在细菌和古细菌的核糖体RNA中起着重要的作用，它能够稳定地与核糖体蛋白结合，形成核糖体的小亚基，并参与到细菌和古细菌的蛋白质合成过程中。
二、意义和应用1. 微生物分类16s rDNA序列在微生物分类中具有重要意义，通过对16s rDNA序列进行测序分析可以鉴定和分类细菌和古细菌的种属和亚属。
这是因为16s rDNA序列在不同种属和不同亚属的细菌和古细菌之间存在一定的变异，可以作为分子生物学特征用于分类鉴定。
2. 微生物多样性研究通过对环境样品中的16s rDNA序列进行测序分析，可以了解微生物裙落的组成和结构，揭示微生物在自然界的分布和多样性。
这对于研究微生物的生态学、环境适应性和生态功能具有重要意义。
3. 微生物系统进化研究利用16s rDNA序列进行系统进化研究，可以揭示细菌和古细菌的系统发育关系和演化过程，为了解细菌和古细菌的起源、多样性和进化提供重要的分子学证据。
三、研究方法1. PCR扩增通常情况下，从细菌或古细菌的DNA中提取16s rDNA序列，然后利用PCR技术进行扩增。
通过选择适当的引物和反应条件，可以特异性地扩增出16s rDNA序列，为后续的测序分析做准备。
2. 测序分析测序是获取16s rDNA序列信息的关键步骤，目前常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。
通过测序分析，可以获得16s rDNA 序列的具体碱基序列信息，用于后续的分类鉴定和系统进化研究。
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16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用*刘文强1，贾玉萍2，赵宏坤3(1.聊城大学农学院，山东聊城252059；2.山东大学生命科学学院，山东济南252100；3.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018)摘要：细菌的16 S 核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。
其具体操作是，以聚合酶链式反应(PCR)分离细菌样本中的16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息，再与16 S rRNA数据库中的序列数据进行比较，确定其在进化中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。
文章综述了16 S rRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法，以及在细菌分类鉴定中的应用。
关键词：16 S rRNA；细菌；鉴定；分类传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。
大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。
20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。
Cai H Y等[1]认为，rRNA基因序列己成为一个分子指标，可以广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。
目前，大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。
随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[2]。
116 S rRNA作为细菌分子鉴定的依据细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23 S rRNA、16 S rRNA和5 S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2 900个，1 540个和120个。
20世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16 S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。
其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。
5 S rRNA虽易分析，但由于核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。
而23 S rRNA含有的核苷酸数几乎是16 S rRNA的2倍，分析较困难。
与此相比，16 S rRNA的相对分子质量适中，作为研究对象较理想。
在相当长的进化过程中，rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了祖先的一些序列。
即rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。
保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。
而且rRNA在细胞中含量大，一个典型的细菌中含有10 000个～20 000个核糖体，易于提取，可以获得足够的使用量，供比较研究之用。
根据核糖体16 S rRNA 结构变化规律，在所测定的区域中包括了V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。
因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rDNA基因的部分序列即可达到对分离物进行分子鉴定的目的[3-5]。
216 S rRNA序列分析鉴定细菌的基本原理和方法通过比较各类生物16 S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。
因此，16 S rRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16 S rRNA序列信息，再与16 S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。
2.1基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。
另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。
一个典型的细菌含有10 000个～20 000个核糖体，而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1个～10个左右)，因此，rRNA在细胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易于降解，RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总DNA，但也可根据情况选择提取rRNA。
由于rRNA在死亡的细胞中很快降解，提取rRNA通过反转录钓取16 S rDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。
2.216 S rRNA基因片段的获得过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到λ噬菌体中建立DNA库，进一步通过16 S rRNA通用探针进行杂交，筛选含有16 S rDNA序列的克隆(鸟枪法)。
由于PCR技术的产生和发展，现在一般采用16 S rRNA引物PCR扩增总DNA 中的rRNA序列，或通过反转录PCR获得互补C rDNA序列后再进行分析。
采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16 S rRNA 序列，而且方便了后面的克隆和测序。
但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用16 S rRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物(Chimeric product)和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。
2.3通过16 S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定16 S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种：①将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16 S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面，但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。
②通过16 S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。
此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。
该方法简单快速，主要应用于快速检测，但可能出现假阳性或假阴性结果。
③对PCR产物进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)分析，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较，分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。
3以16 S rRNA为基础建立的各种方法及其应用细菌培养、免疫学方法等虽广泛应用于对病原菌的检测，但都存在一定的不足，如所需时间长、敏感度低等。
随着分子生物学及基因诊断技术的进步，在分子水平检测微生物，为感染性疾病诊断提供了新的检测手段。
16 S rRNA为所有细菌共有，是细菌进化过程中最为保守的基因，有些基因序列在长期进化过程中始终保持稳定，另外，基于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。
以16 S rRNA基因为基础，建立的PCR、套式PCR、多重半套式PCR、RT-PCR以及寡核苷酸探针已应用于临床细菌的鉴定，序列分析，细菌的分子分类，确定系统发育等[6-7]。
Greisen等设计了细菌共同引物对176种菌株进行16 S rRNA基因高度保守序列PCR，均获阳性结果。
以16 S rRNA的基因片段作探针，检测其在不同霍乱弧菌菌株中由于染色体DNA序列的变异而致杂交谱带差异的分子流行病学方法也有很多应用。
以16 S rRNA的基因片段作探针对霍乱弧菌部分菌株(包括EVC流行株和VCO 139)进行了16 S rRNA基因分型[8]。
细菌16 S rRNA基因兼有保守性和变异性，闫志勇等[9]建立了多重半套式聚合酶链扩增(multiplexsemi nested PCR)的方法，对脑脊液标本中细菌的感染进行检测。
以16 S rRNA作为引物，利用PCR技术来诊断麻风病，在20世纪90年代初期开始出现在国外有关杂志中。
熊俊浩等利用麻风分支杆菌的特异性分子片段16 S rRNA作引物，采用PCR技术，对16 S rRNA分子片段PCR诊断麻风病的特异性方面进行研究。
吴雪琼等发现16 S rRNA基因123 275位核苷酸附近是原核生物高度变异的区域，通过PCR-SSCP方法分析分支杆菌16 S rRNA基因片段，根据其电泳图谱与标准株的相似性进行菌种的初步鉴定。
用16 S rRNA并结合限制性内切酶消化，获得的限制性片段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析。
从20世纪70年代开始，Woese和他的同事们用16 S rRNA寡核苷酸序列分析技术对400多株原核生物和真核生物进行分析。
以细菌特异的引物扩增16 S rRNA，构建质粒文库，用限制性内切酶消化获得16 S rRNA基因型，用基因型的种类及频率对细菌进行鉴定[6-7]。
刘文强等[10]对奶牛链球菌、葡萄球菌和附红细胞体的16 S rRNA进行了PCR扩增和序列分析，并应用于相应疾病的诊断。
4问题和展望环境中的细菌无处不在，所以在试验中如何控制细菌污染是一个关键问题。
通过各个环节的严格无菌操作，选择恰当的扩增循环次数，DNA提取、扩增和产物分析的隔离措施，以及使用一次性吸头等，可提高诊断的正确性和可靠性。
一般PCR通常仅对特定病原体进行检测，而在病原体未明时，需用多种不同引物对多种病原微生物分别进行PCR扩增，往往费时费力，而临床上根本不可能用PCR逐一探测每种可能的病原菌来判断感染的病因，使得PCR技术在临床病原体检测中的应用受到了限制。
核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。
其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，同时其保守性又是相对的，在保守区之间存在着9个～10个变异区(V1～V10)，不同细菌的科、属、种间都有不同程度的差异，故16 S rRNA既可以作为细菌分类的标志，又可作为临床病原菌检测和鉴定的靶分子。
以细菌核糖体16 S rRNA基因为靶分子的PCR，可早期判断细菌感染的存在，并通过对扩增产物的进一步分析对病原菌的种属作出鉴定，弥补了以上不足，是感染性疾病诊断的一个重要突破口，并已成为国内外细菌学家的主要研究方向之一。