实验六__微生物生理生化反应观察

剂的营养琼脂由中性变成碱性，从而产
生颜色变化（由黄色变成深粉红色）。
通过生化管的颜色变化就可以判断接种
的培养基是否产生尿素酶。
4、有些微生物能够分解葡萄糖或乳糖产生
有机酸（乳酸、醋酸、丙酸）使生化管
的PH值降低，从而使含酸碱指示剂溴甲
酚紫的营养琼脂由紫色变成黄色，通过
生化管的颜色变化可以判断是否能产生
生化反应管原理（2）

糖发酵试验，细菌具有多种酶系统能分解糖类，产 酸产气。不同的细菌对各种糖类的分解不同，因而 可以利用糖发酵进行各种细菌(特别是肠道细菌)的 鉴别。
大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖产酸产气。

志贺痢疾杆菌、沙门氏菌、变形杆菌不分解乳糖， 但能分解葡萄糖产酸。
宋内氏痢疾杆菌迟缓发酵乳糖产酸，能分解葡萄糖 产酸。


思考题

接种后的明胶试管可以在37 ℃下培养， 在培养后你必须做什么才能证明水解的 存在?
对你的实验现象进行分析

示 教
肠道致病菌的分离鉴定

分离鉴定步骤
1、分离培养
划线 分离 粪便标本 S-S平板 培养
大，红色，非致病性菌 菌落
小，无色半透明，为可 疑菌落
2、初步鉴定
选取可疑菌落
转种 半固体，双糖铁 培养基 培养 观察培养基变化
结果观察
克氏双糖铁
生化反应管
乳糖
葡萄糖 硫化氢 黄 色 黑 黄 色 色 黄 色 黑 色
尿素 H2S
动 葡萄糖 乳糖
力
大肠杆菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌 变形杆菌
黄 色
+
-
-
-
+
+ +
+
+ + +
红 色 红 色 红 色
+ +
+
+ +
-
+
+
5、乳糖发酵试验：每人接种二支乳糖生化 管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形 杆菌），37℃培养2天，观察和记录每管 培养前后颜色变化，得出结论。
四、实验注意事项

淀粉水解实验，在观察时需要加卢革氏 碘液以便观察淀粉的水解情况；
接种均在无菌条件下操作，接种完毕以 后用灭菌好的棉花塞住管口防止污染； 生化管用砂轮切割玻璃后接种。
相应的糖水解酶类。
三、实验步骤（二人一组）
1.淀粉水解实验：每人接种二支淀粉生化 管（分别接种大肠杆菌和枯草芽孢杆 菌），37℃培养2d，加卢革氏碘液观察 和记录每管颜色变化，得出结论。
2.明胶水解实验：每人接种二支明胶生化
管（分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球
菌），20℃培养2天，从20℃取出即观察
伊红美兰琼脂培养基（ＥＭＢ）选择 培养原理：


此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示剂． （１）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为伊红 和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色，且有金 属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁平混浊，而 较大边缘色淡的菌落。 （２）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等大小， 边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑菌落往往呈 现淡兰色。


此培养基是强选择性培养基中性红为指示剂，酸性时 呈现红色，碱性时呈淡黄色。 在此培养基上，大肠杆菌属的菌落大而混浊，因发酵 乳糖，菌落呈现红色． 志贺氏菌属和沙门氏菌属的菌落形态为光滑无色透明， 园形、中等大小，边缘整齐的菌落。由于宋内氏痢疾 杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖(产酸)较慢 等特点，而使菌落呈淡红或红色的较大或边缘不整齐 的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因 产生硫化 氢，使菌落呈现黑色中心。
3、进一步鉴定 对初步鉴定的菌种进一步做生化鉴定 4、血清学鉴定 肠道杆菌型别较多，常需血清学方法进行确 证 5、药敏试验 为针对性治疗提供依据
（一）肠道杆菌的形态、染色及在选择培养 基上的生长情况


1、常见肠道致病菌菌种：伤寒杆菌、痢疾 杆菌等 2、选择培养基：SS平板、EMB
SS琼脂培养基选择培养原理：
和记录各管的明胶水解情况，得出结论。
3.尿素水解实验：每人接种两支尿素生化 管（分别接种变形杆菌和金黄色葡萄球 菌），37℃培养2天，观察和记录每管培 养前后颜色变化，得出结论。
4、葡萄糖发酵试验：每人接种二支葡萄糖 生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种 变形杆菌），37℃培养2天，观察和记录 每管培养前后颜色变化，得出结论。
（二）肠道杆菌生化反应及动力试验

培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反应管、 半固体培养基
克氏双糖斜面培养基生化反应原理
该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指 示剂酚红。 大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以上层呈黄色，直立段 有气泡存在． 肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖产酸， 使PH下降，因斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量少，所生之 酸接触空气而氧化，又因细苗的生长利用含氮物质生成碱性化合 物，所以斜面部分后来又变成红色．由于直立段(底层)呈厌氧状 态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不被氧化，所以一直呈黄色。大肠 杆菌产气，有动力(沿穿刺线向周围扩散生长)伤寒杆菌有动力， 而痢疾杆菌则没有动力． 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含硫氨基 酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中的亚铁离子结 合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌不产生硫化铁．

生化反应管原理（3）

硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中硫氨基
酸（如胱胺酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚 铁中的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁， 变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能产生硫化铁 痢疾杆菌不产生硫化铁。

方法：



1、克氏双糖铁斜面培养基：分别取四种肠道杆菌 的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于4支 克氏双糖斜面培养基，37℃培养18-24h以后观察 结果。 2、生化反应管：取尿素反应管、硫化氢反应、葡 萄糖反应、乳糖反应管，每种反应管分别穿刺接 种大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌， 37℃培养18-24h以后观察结果。 3、动力试验：分别取四种肠道杆菌的培养物，用 穿刺接种方法接种于4支半固体培养培养基，37℃ 培养18-24h以后观察结果。
方法：

1、分离培养、观察菌落特征：分别取四的 培养物，用分离划线方法接种SS平板或EMB 培养基37℃培养18-24h以后观察结果。

2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培 养物少许涂片，革兰染色、镜检。
菌落观察
SS平板
沙门氏菌：无色透明菌落，有黑色中心 志贺氏菌：无色透明菌落。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
肠道杆菌形态学观察


生化反应管原理（1）


尿素试验：此培养基鉴别沙门氏菌和变形杆菌属 细菌，自铁质双糖培养基上取菌苔作斜面接种， 置37℃恒温箱内培养18—24小时．同时作镜检观 其是否为纯培养． 变形杆菌含有尿素酶，经2—4小时培养能分解培 养基中较多量尿素产生大量的氨，使培养基PH变 为硷性，而呈现红色。即阳性反应，阳性反应可 弃之。 痢疾杆菌属及沙门氏菌属之细菌不能分解尿素而 不呈现碱性反应即阴性反应，阴性反应 需继续作 生化反应及血清学试验。
2.明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质， 在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形 式存在，而在25℃以上明胶会液化。如 果接种的微生物能够产生明胶酶就可以 使明胶生化管在25 ℃以下发生液化，据 此性质可以鉴别产明胶酶的微生物。
3. 尿素酶能够使尿素分解释放出氨气和二
氧化碳，氨溶于水使加有酚红酸碱指示
实验六 微生物生理生化反应观察
一、实验目的

初步了解微生物生化鉴定与分类的原理 与方法；掌握淀粉水解实验、明胶水解 实验、尿素水解实验、糖发酵实验的原 理和方法。
二、实验原理
1.淀粉酶能水解淀粉为小分子的糊精、双 糖和单糖，而淀粉遇碘液会产生蓝色， 因此能产淀粉酶的微生物在淀粉培养基 上培养用碘处理会产生无色区域，据此 可分辨微生物能否产生淀粉酶。