体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的基本流程概要共25页
MP核酸检测试剂盒说明书
肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）说明书【产品名称】通用名称：肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）英文名称：PCR-Fluorescence Detection Kit for Mycoplasma Pneumonia【包装规格】32人份/盒【预期用途】本产品用于定性检测痰液或咽拭子中的肺炎支原体核酸。
肺炎支原体（）是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。
若要明确诊断，需要进行病原体的检测。
而病原体核酸检测是目前最为直接的检测手段。
适应症：由肺炎支原体感染引起的肺炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用肺炎支原体（MP）保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对肺炎支原体核酸的自动化检测。
【主要组成成份】注: 不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月。
【适用仪器】ABI7300、ABI7500荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1. 标本：痰液及咽拭子。
2. 采集器：应当选用国家批准生产的一次性使用的咽拭子，拭子应当包括洁净海绵头、PP杆、PP杆与海绵头应连接牢固，经无尘清洗包装。
3. 采集：样本采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
a. 自然咳痰法以晨痰为佳，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入痰盒中，标本量应大于等于1ml。
b. 咽拭子取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，转动拭子取出粘液。
4.存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
引物设计与检测全过程
引物设计与检测全过程引物设计是引物检测的第一步，目的是选择能够特异性地识别目标序列的引物。
引物通常由20-25个碱基组成，具有一定的GC含量，理论上GC含量应在40-60%之间。
引物设计时需要遵循以下几个原则：1.引物中不能出现序列重复或自身互补配对，以避免引物间产生二聚体或内聚体。
2.引物不能与非目标序列相互匹配，以避免非特异扩增。
3.引物的长度应适中，太短会导致非特异扩增，太长则会限制扩增效率。
4.引物的温度与Tm（解链温度）适配，以保证引物的特异性。
引物设计可以使用基于计算机的软件（如Primer3、OligoAnalyzer 等）或手动设计。
计算机软件会根据用户提供的目标序列，自动生成合适的引物。
引物设计完成后，接下来是引物的合成。
合成引物通常通过化学合成的方法，在合成过程中会使用特殊的保护基团来保护合成中间体，最后通过去保护反应来得到合成的引物。
得到合成的引物后，需要进行质量检测。
引物检测的主要目的是确保引物的纯度和正确性。
引物检测方法有多种，常用的包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和高效液相色谱等。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，引物经过电泳后，通过观察引物的迁移位置和带电量来判断引物的纯度和大小。
毛细管电泳是一种高效的引物检测方法，它能够提供引物的准确分离和确定大小。
高效液相色谱是一种基于溶液中组分在固定相表面的亲和作用分离的方法，可以快速准确地分析引物的纯度。
完成引物的质量检测后，即可用于目标序列的扩增。
引物的扩增可以使用PCR（聚合酶链反应）方法。
在PCR反应中，引物与模板DNA进行互补配对，通过引物自身的特异性，选择性地扩增目标序列。
PCR反应通常包含三个步骤：变性（使DNA解链），退火（引物与DNA模板互相结合）和延伸（通过DNA聚合酶合成新的DNA链）。
PCR反应需要使用特定的引物和一定的温度条件，以产生特异性扩增。
扩增后的目标片段可以通过凝胶电泳等方法进行分析和检测。
凝胶电泳会根据目标片段的大小和电荷量来进行分离和分析。
体外诊断试剂生产质量控制要点
四临床化学诊断试剂产品 葡萄糖试剂盒（液体单试剂）（氧化酶法）
一.酶联免疫诊断试剂产品
【产品名称】 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）
【包装规格】 96人份/盒 【预期用途】 本试剂盒采用酶联免疫法原理检测HBsAg，适用于血清或 血浆类标本。
酶联免疫法反应原理
双抗体夹心法
双抗原夹心法
反应板制备
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反应板制备
包被液配制
质量控制点：包被缓冲液pH
测定方法：用pH计测定
反应板制备
反应板的包被
质量控制点：包被液量的准确性 要求：100μl/孔 操作： 将待包被的微孔反应板放置传送带上，开始包被，每块包被 板应用目测法检查其96孔加液是否完整。前10块包被板检查加 液量是否准确，检后的包被板放入报废专用盘内，作报废处理。 连续100块包被板检查合格后，进入正常包被过程。正常包 被过程中每100块包被板应抽1块作过程检查。
体外诊断试剂生产和质量控制要点
主讲人:顾燕黎
上海科华生物工程股份有限公司
体外诊断试剂产品介绍
一酶联免疫诊断试剂产品 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 二快速诊断试剂产品 人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒（胶体金法） 三PCR核酸诊断试剂产品 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
标本
抗-HBs-HRP
HBsAg
抗-HBs
乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶 联免疫法）的原理
采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后， 加入抗-HBs-HRP，当样本中存在HBsAg时，该HBsAg 与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBsHBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反 应，反之则无显色反应。
DNase 检测试剂盒(荧光探针法)盒操作手册说明书
DNase检测试剂盒(荧光探针法)盒操作手册DNase检测试剂盒基于荧光基团标记的DNA探针，其一端标记有荧光报告基团分子（Fluor），另一端标记有淬灭基团。
当样本中不含DNase活性时，该探针稳定存在，淬灭基团的物理接近会将荧光报告基团中的荧光淬灭到极低水平，不会产生荧光信号；当样本中含有DNase活性时，探针被降解，荧光报告基团和淬灭基团在溶液中的空间上发生分离，产生逐渐增强的荧光信号；荧光信号增加的速率与酶的数量和活性成正相关。
一．主要组成成分及储存条件名称HBP002902（192T）HBP002903（48T）储存温度DNA探针1管1管-25~-15℃TE缓冲液 2.0mL0.5mL-25~-15℃DNase I标准品20μL10μL-25~-15℃(2U/μL)标准品稀释液12mL6mL-25~-15℃无DNase无DNase水25mL25mL-25~30℃二．预期用途可定量或定性检测单个环境，试剂或者耗材样品中的DNase，判断样本是否被DNase污染。
三．实验环境1.操作过程中需全程穿戴实验服，手套和口罩，严格控制DNase污染；2.为了防止操作过程中引入外源的DNase，前期加样请在超净工作台中进行，实验前用核酸酶清除剂清洁超净工作台中的操作表面，并打开超清洁工作平台紫外照射30分钟；3.其他工作区域在整个实验开始前，也先使用核酸酶清除剂对实验环境进行处理。
四．客户自备耗材仪器210μL移液器桌面离心机3100μL移液器qPCR仪/酶标仪4200μL移液器5DNase DNase free枪头6200μL EP管72ml棕色EP管8黑色平底酶标板/PCR96孔板（高管）9核酸酶清除剂10无酶水11离心管架本实验操作根据酶标仪增益功能不同，分为3种类型进行详细说明，用户可根据自己酶标仪的具体功能，选择对应的实验操作方法。
1.具备自动优化+手动设置增益值的酶标仪，以下以Tecan Spark为例；2.只能选择自动优化或者高中低增益值的酶标仪，以下以SpectraMax iD5为例；3.对于不具备自动优化的酶标仪，比如Fluoroskan FL，这种酶标仪不推荐使用，此时建议使用具有FAM通道的qPCR仪，以下以Thermofisher7500为例。
核酸探针描述
④Klenow片段快速标记DNA探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链
N— 5ˊ→3ˊ外切酶
3ˊ→5ˊ外切酶
5ˊ→3ˊ聚合酶 —C
小片段(36000)
Klenow片段（67000）
5′—GAATTC—3′ 3′—CTTAAG—5′
EcoRⅠ
5′——G 3′——CTTAA
AATTC——3′ G——5′
滤纸
固定到载体
吸水纸 载体
凝胶 缓冲液
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2. Northern印迹杂交 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到
NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质 印迹技术则被称为Western blotting。 3. 斑点杂交（dot blot ）(线状圆形)
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4.原位杂交（in situ hybridization） 直接用探针与细胞或组织切片中的
Klenow, dNTP,[α-32P]dATP
5ˊ——GAATT AATTC——3ˊ 3ˊ——CTTAA TTAAG——5
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（二）常用的非放射性标记
优点：无环境污染，可较长时间贮存
方法：1.酶标记法 2.化学标记法
要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异 亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响 甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛 （digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、 补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）
核酸杂交。 应用：1）观察基因在组织中的表达
2）确定基因在染色体中的定位
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新冠病毒核酸检测试剂配制、扩增区工作流程
新冠病毒核酸检测试剂配制、扩增区工作
流程
确认转运箱，转运箱外表75%酒精喷雾消毒。
生物安全柜内打开转运箱（开箱瞬间75%酒精喷雾消毒）。
核对当天新冠病毒核酸检测标本信息并录入电脑、LIS系统。
紫外消毒30分钟。
清理核酸提取人员穿戴防护用品产生的垃圾
护目镜紫外照射30分钟后擦拭干净放回原位
注意收听对讲机通知，协助核酸提取人员工作
核酸提取试剂4℃冰箱复温，按需配制扩增体系完善《核酸检测标本登记表》《核酸检测试剂出入库表》
样本上机检测
待核酸提取人员出来后开启所有房间紫外灯，照射30分钟后关闭。
结果读取、保存、报告审核。
完善《核酸检测标本登记表》及电子表格。
向科主任报告检测结果。
关闭核酸提取室生物安全柜紫外灯、传递窗紫外灯、移动紫外灯。
将转运箱放至5号窗口。
系好双层黄色垃圾袋，交由专业人员高压灭菌并记实签字，依照感染性医疗废弃物处置惩罚。
体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的基本流程共25页文档
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的 基本流程
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
பைடு நூலகம்
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
核酸引物探针质量技术要求
核酸引物探针质量技术要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：核酸引物探针是分子生物学实验中常用的一种工具，用于特异性检测和测定目标DNA或RNA序列。
其质量的好坏直接影响实验结果的准确性和可靠性。
制定和遵守一定的技术要求对于保证核酸引物探针的质量至关重要。
一、引物序列设计核酸引物探针的设计是其质量的重要基础。
在设计引物时，需要考虑以下几个方面：1. 引物的长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，需要保证引物足够长以确保特异性结合目标序列，同时又不能过长影响反应效率。
2. 引物的GC含量：引物中GC含量的合理范围通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。
3. 引物的特异性：引物的特异性是指引物与目标序列的互补性，需要确保引物与非目标序列的互补性尽可能小以避免干扰。
4. 引物的末端结构：引物的末端结构需要考虑到PCR扩增、杂交和捕获等不同实验操作的需求，合理设计引物的末端结构有助于提高实验效率。
二、引物检测和验证在使用核酸引物探针前，需要对引物进行检测和验证，以确保其质量符合要求。
主要检测方法包括：1. 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，检测引物的纯度和长度。
2. 透射电子显微镜观察：可以通过透射电子显微镜观察引物的形态和结构，判断引物的合成质量。
3. 质谱分析：利用质谱分析技术，可以检测引物的精确质量和序列。
三、引物处理和保存引物的处理和保存也对其质量起到重要影响，以下是一些常用的处理和保存方法：1. 复溶：引物在使用前需要以适当的溶剂复溶，避免在处理过程中引物受损。
2. 冻干：可以利用冻干技术将引物保存在干燥状态，减少引物的降解和污染。
3. -20℃或更低温度保存：引物应该保存在-20℃或更低的温度下，避免被高温或光照导致降解。
四、实验操作规范在进行核酸引物探针实验时，需要严格遵守实验操作规范，包括以下几个方面：1. 避免污染：实验前准备工作台、试剂和仪器时要避免污染，以确保实验结果的准确性。
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36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
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