黄芪糖蛋白对T淋巴细胞增殖活性的影响

鼠脾淋巴细胞 [ 4 ] , 调节细胞悬液密度为 3 ×109 /L , 并用台盼蓝染色检测细胞活力 > 95%。于 96 孔平 底细胞培养板中每孔加入制备好的细胞悬液 100 μl 及 ConA 6 μl (终浓度 3 μg /m l) 。分别于不同时间 加入同一浓度 HQGP ( 5 μg /m l) 。细胞孵育开始时 加入 HPGP记为 0 h,孵育 12小时记为 12 h,以此类 推 。将实验分为 7 个组 ( n = 4 ) ,分别为 0、12、24、 36、48、60 h,对照组仅加入完全 RPM I 1640 培养基 , 不加 HQGP。终体积为 200 μl。于 37 ℃、5 % CO2 培 养箱中孵育 72 h,M TT法在酶标仪上测 OD570吸光 值 ,以表示淋巴细胞转化增殖的能力 。 1. 3 与 T淋巴细胞活化程度的关系 于 96孔平底 细胞培养板中每孔加入制备好的细胞悬液 100 μl、 HQGP (5 μg /m l)及不同浓度的 ConA。将实验分为 6个组 ( n = 3 ) , ConA 浓度分别为 0、0. 5、1. 0、2. 0、 4. 0、6. 0μg /m l。对照组分别加以上不同浓度的 Co2 nA ,但不加 HQGP。终体积为 200 μl。孵育及检测 方法同 1. 2。计算刺激指数 : SI =实验组 OD570 值 / 对照组 OD570值 ,表示细胞的增殖反应 。 1. 4 双向混合淋巴反应 (MLR ) 分别取 C57BL /6J 和 Balb /C小鼠脾脏制备细胞悬液 ,调整细胞密度均 为 2 ×109 /L。96孔平底细胞培养板中 ,每孔中分别 加入两种脾细胞悬液各 100 μl、不同浓度的 HQGP。 设实验 组 7 个 ( n = 3 ) , HQGP 的 浓 度 分 别 为 0、 0. 05、0. 1、0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 μg /m l。另 设 单 独 C57BL细胞孔 、单独 Balb /C 细胞孔 。于 37℃、5% CO2 培养箱中孵育 96 h。M TT测定方法同 1. 2。
在治疗自身免疫性疾病和器官移植抗排异反应 中 ,免疫抑制剂被大量使用 ,但现在临床上使用的西 药类免疫抑制剂毒副作用大 ,造成机会性感染 、诱发 肿瘤 。中药历来以药效广泛 、毒副作用小为优点 ,恰
FTY720[ 6 ] 。因此开发中药免疫抑制剂的意义十分 重大 。
研究认为 T细胞在免疫应答中起主要作用 。在 临床免疫抑制药物中以阻滞刺激 T细胞的信号通路
图 2 对双向混合淋巴反应的抑制作用
好可以弥补西药的不足 。对于长期用药的慢性排
注 :与对照组比较 , 3 P < 0. 05。
3 讨论
异 、自身免疫性疾病也可以采用中药 。但如今国内 研究成熟的中药免疫抑制剂只有雷公藤多苷 [ 5 ] ,国 外有 日 本 研 发 的 冬 虫 夏 草 提 取 物 的 修 饰 产 品
黄芪为补气常用中药 ,中药药理研究显示其组 分黄芪多糖具有显著的免疫增强活性 [ 1 ] ,黄芪及其 有效部位具有免疫调节的作用 [ 2 ] 。本课题组从黄 芪中提取得到一种具有免疫抑制活性的物质 ———黄 芪糖蛋白 ( Huangqi Glycop rotein, HQGP) ,并已申请 国家专利 [ 3 ] 。初步的实验研究表明 , HQGP能够明 显抑制 ConA、LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞体外增 殖 。为此 ,本研究进一步探讨其免疫抑制作用与给 药时间 、T淋巴细胞的活化程度的关系 ,以及对混合 淋巴反应的影响 。
而获得免疫耐受 [ 7 ] ,如现在常用的免疫抑制药物环 孢素 A (C sA ) [ 8 ] 、雷帕霉素 ( RAPA ) [ 9 ]等 。ConA 是 刺激 T淋巴细胞活化的细胞丝裂原 。
本研究对体外培养的小鼠脾淋巴细胞以不同时 间给予黄芪糖蛋白 ,结果表明其对 T细胞增殖的抑 制作用发生于细胞增殖的早期 ,细胞培养 36 h之后 加入黄芪糖蛋白无明显的抑制作用 。用不同浓度 ConA 刺激 T淋巴细胞使之活化 ,随着 ConA 浓度增 大 ,细胞增殖能力增强 。但黄芪糖蛋白的抑制活性 与小鼠脾 T淋巴细胞的活化程度无正相关性 。
[基金项目 ] 山西省自然科学基金资助项目 (200901101321) [作者简介 ] 杨向竹 (1970 - ) ,女 ,内蒙古包头人 ,在读博士 生 ,主要从事方药物质基础的现代研究 。 [通讯作者 ] 冯前进 ,教授 ,博士生导师 。 E2mail: xyqj728119@ yahoo. com. cn
杨向竹 1 薛慧清 2 冯前进 2 牛 欣 1 赵俊云 1 马 鑫 1
1. 北京中医药大学 (北京 100029) 2. 山西中医学院 (山西 太原 030024)
【摘 要 】目的 : 探讨黄芪糖蛋白 (HQGP)对 T淋巴细胞增殖与给药时间的关系 、T淋巴细胞增殖与活化程 度的关系 ,以及对双向混合淋巴反应的影响 。方法 : 体外培养小鼠脾细胞 ,M TT法测定在不同时间给予一 定浓度 HQGP、给予相同浓度 HQGP 和不同浓度 ConA 刺激 ,双向混合淋巴反应对 T细胞增殖的影响 。 结果 : HQGP在不同时间对 ConA 刺激的 T淋巴细胞增殖均有抑制作用 ,但培养 12 h给药的抑制作用最强 ; 其抑制作用与 T细胞的活化程度无相关性 ;能明显抑制双向混合淋巴反应 ,并呈剂量依赖性 。结论 : 在体 外实验中 , HQGP对小鼠脾淋巴细胞增殖具有免疫抑制活性 ,且与活化程度无相关性 。 【关键词 】 黄芪糖蛋白 ;淋巴细胞转化 ;免疫抑制 【中图分类号 】 R285. 5 【文献标志码 】A 【文章编号 】10082861X (2009) 0520066203
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AC TA U N IV ER SITA T IS TRAD IT IO N IS M ED ICAL IS S IN EN SIS PHARM ACO LO G IA EQ U E SHAN GHA I V o.l 23 N o. 5 Sep., 2009
方药研究
黄芪糖蛋白对 T淋巴细胞增殖活性的影响
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0. 502 2
0. 5 0. 332 1 ±0. 026▲ 0. 195 5 ±0. 015△★ 0. 588 6
1. 0 0. 498 4 ±0. 062▲ 0. 296 0 ±0. 017△★ 0. 593 8
2. 0 0. 793 8 ±0. 031▲ 0. 617 3 ±0. 023△★ 0. 777 7
表 3 对小鼠同种异体双向混合淋巴细胞反应的抑 制作用 ( n = 3 )
组别 剂量 (μg /m l) OD570
抑制率 ( % )
对照组 HQGP - 1 0. 05 HQGP - 2 0. 1 HQGP - 3 0. 5 HQGP - 4 1. 0 HQGP - 5 5. 0 HQGP - 6 10. 0
图 1 对 T淋巴细胞抑制作用与给药时间的关系
2. 2 与 T淋巴细胞活化程度的关系 无论对照组 还是给药组 ,淋巴细胞的增殖随着 ConA 浓度的增 加而增大 ,与各自相应的空白对照比较均有显著性 差异 ( P < 0. 05 ) ; 同时 HQGP ( 5 μg /m l)作用后 ,不
组别
剂量 (μg/m l) OD570
同 ConA 浓度下脾淋巴细胞的增殖均被抑制 ,且差
对照
-
0. 906 0 ±0. 111 7
异显著 ( P < 0. 05 ) 。但从刺激指数看 ,淋巴细胞活
0h
5
0. 767 4 ±0. 163 53
化程度与 HQGP 的抑制作用没有正相关性 。见表
12 h 24 h 36 h 48 h 60 h
5
0. 639 1 ±0. 048 53
5
0. 701 5 ±0. 082 83
5
0. 794 9 ±0. 018 5
5
0. 857 7 ±0. 034 2
5
0. 883 6 ±0. 036 4
2。 2. 3 对 双 向 混 合 淋 巴 反 应 的 影 响 不 同 浓 度 HQGP对双向混合淋巴反应均有抑制作用 ,在 0. 1、 1. 0、5. 0、10. 0 μg /m l时与对照比较有显著性差异
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上海中医药大学学报 第 23卷 第 5期 2009年 9月
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1. 5 统计学方法 所获数据用 x ±s 表示 , 应用 SPSS 13. 0软件进行统计学处理 ,各组均数之间比 较进行 one2way ANOVA 检验 。
注 :与对照组比较 , 3 P < 0. 05。
( P < 0. 05) ,且总趋势呈剂量依赖性 。见表 3、图 2。
表 2 对淋巴细胞增殖抑制与其活化程度的关系 ( n = 3, x ±s)
Hale Waihona Puke ConA (μg/m l) 对照组 OD570 给药组 OD570
刺激指数
0 0. 135 2 ±0. 002 0. 067 9 ±0. 046
1 材料与方法
1. 1 实验材料 1. 1. 1 动 物 8 ～ 12 周 龄 雄 性 B alb / c 小 鼠 , B57BL /6J小鼠 ,购自中国医学科学院实验动物研究 所 ,动物合格证号 : SCXK (京 ) 2004 20001。 1. 1. 2 试剂 黄芪糖蛋白 ,自制 ;刀豆蛋白 A ( Co2 nA ) 、四噻唑盐 (M TT) 、Tris、SDS, Sigma 公司产品 ; RPM I 1640培养基 ( Hyclone改良型 ) 、青霉素 、链霉 素 ,赛默飞世尔生物化学制品 (北京 ) 有限公司生 产 ;小牛血清 ,杭州四季青生物材料有限公司提供 。 1. 2 对淋巴细胞增殖影响的时效性 常规制备小