短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达
木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达
木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达摘要：本实验通过克隆木聚糖酶基因到pTE28a表达载体上，转化BL21表达菌株，用IPTG诱导重组菌，跑SDS-PAGE后，在目的条带处有目的蛋白的表达，用western blot鉴定该蛋白，确信目的条带是目标蛋白。
同时，把目的条带克隆到pPIC9K 载体上,转化毕赤酵母表达菌株GS115，甲醇诱导重组酵母，测得木聚糖酶的活性可以达到2.375U/mL。
关键字：木聚糖酶；原核表达；真核表达材料与方法1.1菌种来源本实验所用菌种来自于华中农业大学农业微生物国家重点实验室。
1.2培养基LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0YPD培养基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，葡萄糖20 g/LBMMY培养基：蛋白胨20 g，酵母抽提物10g，100ml 13.4%YNB，2ml 0.02%生物素,5g甲醇，100ml 1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0),定容至1L1.3菌种的活化将甘油管保存的含空载和目的基因的重组大肠杆菌表达菌株在含有50ug/mL的卡那霉素的固体LB培养基中划线，过夜培养，挑取单菌落到含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，培养至对数期，这就是活化的菌株。
同时，将甘油管保存的含空载和目的基因的重组毕赤酵母GS115菌株在YPD固体平板上划线，培养至长出单菌落，挑取单菌落到YPD液体培养基中培养至对数期，备用。
1.4重组菌的诱导表达1.4.1重组大肠杆菌的诱导表达按1%的接种量把活化好的重组大肠杆菌接到50ml的含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6，添加终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6-8h，离心收集菌体，加PBS溶液重悬破碎，再高速离心，取上清液过Ni柱，收集适当咪唑浓度洗脱的蛋白质，跑SDS-PAGE,并做western blot验证目标蛋白。
木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达
木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达摘要参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列，以引物拼接方式，人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA，插入pET-20b载体，获得重组表达载体pET-20b-xynA。
重组菌在16 ℃下诱导效果最好，10 h酶活达到42.05 U/mL，重组酶占全细胞蛋白的47%，粗酶在65 ℃和pH 5～8条件下很稳定。
关键词木聚糖酶A基因；优势密码子；高效表达β-1，4-D-木聚糖水解酶目前已经得到广泛应用，耐热、耐碱、热稳定性好是其理想的特征，其水解产物低聚木糖以木二糖、木三糖为主[1-2]。
低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖能力、不被消化等特性，但是自然界木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性，影响了低聚木糖的产率。
因此，构建产木聚糖酶的工程菌，已成为生物技术在食品工业的研究热点。
疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌，产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定，降解产物中单糖含量很少[3]。
该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂，但是嗜热真菌培养比较困难，产酶周期长且酶系复杂。
在原核系统中重组表达的产量很低，不能满足应用要求[4]。
该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子，以引物拼接的方式合成基因，利用pET-20b载体在16 ℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。
1 材料和方法1.1 引物设计根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列，在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子，设计14条引物合成基因xynA，相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸（图1）。
1.2 引物片断的拼接参照美国Promega公司的Altered SitesⅡProtocol的方法，将14条引物混合磷酸化，产物75 ℃变性后，以大约1 ℃/min的速度缓慢降温至45 ℃退火，再迅速降至22 ℃终止退火。
加入DNA聚合酶和连接酶，37 ℃下延伸和补平。
1.3 目的基因xynA的克隆设计上下游引物C1和C2，EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点分别为黑体所示：C1：CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC；C2：CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。
短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达
ｍｉ ５ ｎ， ０Ｃ退 火 １ ｍｉ ７ ℃ 延 伸 ２ ｍｉ 进 行 ３ ｏ ｎ， ２ ｎ； ０个 循
Ｈ１ ２菌 株 ， 离 自 土 壤 ； 肠 杆 菌 表 达 载 体 分 大
ｐ Ｔ ０ ， ｏ ａｅ Ｅ ２ ｂ Ｎ ｖ ｇ ｎ公 司 ； 限制 性 内切 酶 、 ＮＡ 连 接 ＴＤ 酶 、 ａ Ｔ ｑＤＮＡ聚合 酶 、ＭＤ ８Ｔ载 体及 蛋 白分子量 标 ｐ １一 准 ， ａ Ｒ 公 司 ； 甲基纤 维素 （ ＭＣ ， ｉｍａ 司 ； Ｔ Ｋａ ａ 羧 Ｃ ） Ｓｇ 公
葡 聚 糖 酶 ， 广 泛 应 用 于 洗 涤 剂 、 染 、 墨 等 行 已 印 脱
业 ］ 应用前 景 广 阔 。从 自然 界 中筛 选 高 活 力 的 ， １ ４葡 聚糖 内切 酶产 生 菌 ， 隆其 基 因并 利 用 强 启 动 ，一 克
子 进 行 表 达 是 提 高 酶 产 量 的 重 要 措 施 。到 目前 为 止 ， 虽 然 已有 一 些 １ ４葡 聚 糖 内 切 酶 基 因 被 克 隆 并 得 到 ，一
ＤＮＡ 分 子 量 标 准 ， ＡＮＧＥＮ 公 司 ； 回 收 试 剂 盒 ， ＴＩ 胶
环 ， 后 ７ ℃延伸 １ ｉ。将 Ｐ Ｒ扩 增 得 到 的 ２ ｋ】 最 ２ ０ｒ ｎ ａ Ｃ ｝ 条带 胶 回收 ， 后与 ｐ 然 ＭＤ１一 载体 连 接 ， 化 大肠 杆 ８Ｔ 转
Ｅ ｌ 将 其 转 化 至 大 肠 杆 茵 Ｂ ２ （ Ｅ ） 株 中进 行 表 达 。结 果 表 明 ， 基 因 大 小 为 １ ８ ｐ 共 编码 ６ ９个 氨 基 酸 ； ｇ Ａ， Ｌ ＩＤ ３茵 该 ９ ０ｂ ， ５ 对
耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究
耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究刘伟丰;毛爱军;祝令香;赵云;董志扬【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2004(44)4【摘要】从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP51中克隆得到木聚糖酶基因xynA,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1520中得到重组质粒pWSX11.xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达.采用同源高效表达策略,以原生质体转化方法将pWSX11转回原始菌株BP51中,获得重组菌株BPX11.通过木糖诱导重组菌株中的xynA基因高效分泌表达,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP51提高了87%,同时对重组表达的木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究.【总页数】4页(P487-490)【作者】刘伟丰;毛爱军;祝令香;赵云;董志扬【作者单位】中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;周煌凯;段春燕;龚月生2.短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究 [J], 江正兵;宋慧婷;马立新3.短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;乔宇;于巍;董志扬4.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;段玉兰;周煌凯;段者燕;龚月生5.耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化 [J], 周煌凯;龚月生;杨明明;张云雁;宋秀平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶(xylB)的分子生物学研究
短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶(xylB)的分子生物学研究胡春霞;陆平;李卫芬;许梓荣【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2009(028)001【摘要】根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.【总页数】5页(P86-90)【作者】胡春霞;陆平;李卫芬;许梓荣【作者单位】浙江大学,教育部动物分子营养重点实验室,浙江,杭州,310029;绍兴文理学院,元培学院生命科学系,浙江,绍兴,312000;浙江大学,教育部动物分子营养重点实验室,浙江,杭州,310029;浙江大学,教育部动物分子营养重点实验室,浙江,杭州,310029;浙江大学,教育部动物分子营养重点实验室,浙江,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】Q55;Q785;Q786【相关文献】1.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;周煌凯;段春燕;龚月生2.耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;赵云;董志扬3.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;段玉兰;周煌凯;段者燕;龚月生4.耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化 [J], 周煌凯;龚月生;杨明明;张云雁;宋秀平5.短小芽孢杆菌A-30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究 [J], 刘相梅;祁蒙;吴志红;林建强;曲音波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木聚糖酶基因克隆及表达系统建立
木聚糖酶基因克隆及表达系统建立一、木聚糖酶基因克隆概述木聚糖酶是一类能够分解木聚糖的酶类，木聚糖是植物细胞壁中含量丰富的多糖之一，由木糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
木聚糖酶在食品工业、饲料工业、造纸工业以及生物能源领域具有广泛的应用。
基因克隆技术是现代生物技术中的一项重要技术，它允许科学家在体外复制和修饰特定的基因，进而在宿主细胞中表达目标蛋白。
木聚糖酶基因克隆的目的在于获得高效表达的木聚糖酶，以满足工业生产的需求。
1.1 木聚糖酶基因克隆的重要性木聚糖酶基因克隆对于提高木聚糖酶的生产效率、降低生产成本以及开发新型木聚糖酶具有重要意义。
通过基因克隆，可以对木聚糖酶基因进行优化，提高其在宿主细胞中的表达水平，从而获得更高效、更稳定的酶制剂。
1.2 木聚糖酶基因克隆的技术路线木聚糖酶基因克隆通常包括以下几个步骤：基因的获取、基因的扩增、基因的克隆、基因的表达以及表达产物的纯化和鉴定。
首先，需要从自然界中筛选出具有高效木聚糖酶活性的微生物，然后通过PCR技术扩增其木聚糖酶基因。
接着，将扩增的基因克隆到合适的表达载体中，转化到宿主细胞，使其在宿主细胞中表达。
最后，通过一系列纯化步骤获得高纯度的木聚糖酶，并对其进行活性鉴定。
二、木聚糖酶基因克隆的关键技术木聚糖酶基因克隆过程中涉及到多种关键技术，包括基因克隆载体的选择、宿主细胞的选择、基因表达的调控以及表达产物的纯化和鉴定等。
2.1 基因克隆载体的选择基因克隆载体是用于携带外源基因进入宿主细胞并在其中表达的DNA分子。
载体的选择对基因的表达效率和稳定性至关重要。
理想的载体应具备以下特点：能够高效地在宿主细胞中复制、具有多个限制酶切割位点以便于基因的插入、含有选择标记基因以便于筛选转化子、以及能够高效地表达外源基因。
2.2 宿主细胞的选择宿主细胞是基因克隆的另一个关键因素。
不同的宿主细胞具有不同的基因表达能力和稳定性。
常见的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达
基 金 项 目 ： 州 市 科 技 局 科研 项 目 （ 杭 ＫＨ１ ３ ５ ２ ０ ０ ３ Ｔ０ ） ０ ６ ；０ ９２ １ ６ ． 通信作者 ： 黎锋（９９ ）男， 黄 １ ７ 一 ， 副研 究 员 ， 士 ， 要 从 事 分 子生 物 学 与 酶 学 研 究 ． — ｉ： ｕ ｎ ＠ ｈ ｎ ． ｄ ． ｎ 博 主 Ｅ ｍａ ｈ ａ ｇ ｚ ｕ ｅ ｕ ｃ ｌ
ＧＡＡ， ｐ ＲｓＧＡＡＣ Ｂ —ａ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＴ ＧＡＴ Ｃ ＴＣ 扩 增 条 件 ： ４℃ １ ｎ ９ ＴＣ Ｃ Ｔ， ９ ０ ｍｉ ； ４℃ ３ ，５ ０ Ｓ ０℃ ４ ， ５Ｓ ７ ２℃ ９ ， ０个循 环 ； ２℃ １ ｎ Ｐ Ｒ 产 物 经 １ ０ 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 检 测 ， ０Ｓ ３ ７ ０ ｍｉ． Ｃ ． 目的 片段 切 胶 回收 ， 与
糖部 分转 移至 糖 、 白质 、 蛋 脂类 、 核酸 以及 另外一 些小 分子 ， 即完 成糖 基 化反 应 ， 成 具有 很 多 生 物学 功 能 形
的糖 基化 产物 ＿ ］ 糖基 转移 酶在所 有生 命体 中都扮 演着 重要 的生 物学 角色 ， １． 日益 引起 人们 的重 视． 白质 蛋
王秋 艳 ， 袁 洋 ， 海峰 ， 亚 丽 ， 黎 锋 蓝 李 张 黄
（ 州 师 范大 学 生 物 医药 与 健 康 中 心 ， 江 杭 州 ３ １ ２ ） 杭 浙 １ １ １
摘
要 ：为 获得 具有 催 化 活性 的糖 基 转 移 酶 纯 酶 ， 研 究 以短 小 芽 孢 杆 菌 基 因组 Ｄ 本 ＮＡ 为 模 板 ， 用 简 并 利
的糖 基化 修饰 和天 然糖蛋 白的去糖基 化 是研究 糖蛋 白糖 链 结构 和 功能 的重要 手 段 之一 ． 中糖 基转 移 酶 其 是该 反应 中 的有用工 具． 已纯化 的糖 基转 移酶是 目前 糖基 化工程 中的重要 酶 ， 为研究 糖蛋 白糖 链 的结构 与 功能 的关 系 以及细胞 表 面糖基 化修饰 提供 了极 好 的方 法 ］ 目前 对 这 些酶 的研 究还 处 于 起 步 阶段 ， 化 ． 纯 的酶 种类 依然 很少 ． 本实 验利用 Ｐ Ｒ技 术从 短小 芽孢 杆菌 中克 隆 了糖 基转 移 酶 基 因 ， 建 了原 核表 达 重 Ｃ 构 组质 粒 ， 在大 肠杆 菌 中诱 导 表 达 ， 化 后 测 定 其 活 性 ， 利 用 糖 基 转 移 酶进 行 活性 产 物 改 造 提 供 了有 利 纯 为
木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶的基因克隆及表达木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。
木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。
木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。
在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。
因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。
本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。
1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。
研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。
国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。
20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。
目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。
木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。
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短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的扩增及表达——分子生物学实验设计马骏刘怡王艳丽赵玮（周五314 1组 2组）一：短小芽孢杆菌染色体DNA的提取：1.培养5mL细菌至饱和状态，取1.5mL培养物4000r/min 离心2min。
弃上清。
2.沉淀物加入TE缓冲液567μL，用吸管反复吹打使之重悬。
加入30μL10%的SDS和3μL20 mg/mL 的蛋白酶K，混匀，于37℃水浴1小时。
3.加入100μL 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。
4.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心12000r/min 4-5min，将上清液转入一个新的指管中（用扩口枪头）。
5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心12000r/min 5min，将上清液转入一个新的指管中（用扩口枪头）。
6.加入0.6体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀下来，离心12000r/min 5min，弃上清，稍干燥，用1mL 70%的乙醇洗涤沉淀，震荡并离心5min，弃上清，空气中干燥。
7.加100μL TE缓冲液，存放4℃，过夜溶解。
二：引物设计：根据NCBI文献报道的短小芽孢杆菌木聚糖酶基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计并分析引物如下：PstⅠPrimer 1:5’-GCTGCTGCAGAGGAGAGGAATGACGAATGA-3’Bam HⅠPrimer 2:5’-GCAGGATCCGACATGGTTCGTGTGCTGAAT-3’其中引物1中含有PstⅠ酶切位点，该位点前面有4个保护碱基，引物2中含有Bam HⅠ酶切位点，该位点前面有3个保护碱基。
FEATURES Location/Qualifierssource 1..1011/organism="Bacillus pumilus"/db_xref="taxon:1408"CDS 44..730/codon_start=1/transl_table=11/product="endo-1,4-xylanase"/protein_id="AAM08361.1"/db_xref="GI:19919754"/translation="MNLRKLRLLFVMCIGLTLILTAVPAHARTITNNEMGNHSGYDYELWEDYGNTSMTLNNGGALSAGWNNIGNALFRKGRKFDSTRTHHQLGNISINYNASFNPGGNSYLCVYGWTQSPLAEYYIVDSWGTYRPTGAYKGSFYADGGTYDIYETTRVNQPSIIGIATFKQYWSVRQTKRTSGTVSVSAHFRKWESLGMPMGKMYETAFTVEGYQSSGSANVMTNQLFIGN"BASE COUNT 317 a 216 c 223 g 255 tORIGINPrimer 11 gagatgacag aattaaaagg atgaaaaagg agaggaatgg acgatgaatt tgagaaaatt61 aagactgttg tttgtgatgt gtattggact gacgcttata ctgacggctg taccagccca121 tgcgagaacc attacgaata atgaaatggg taaccatagc gggtacgatt atgaattatg181 ggaggattat ggaaatacct cgatgacact caataacggc ggggcactta gtgcaggctg241 gaacaatatc ggaaatgctt tatttagaaa agggagaaag tttgattcca ctagaactca301 ccatcagctt ggcaacatct ccatcaatta caacgcaagt tttaacccag gcgggaattc361 ctatctatgt gtctatggct ggacacaatc tccattagca gaatactaca ttgttgattc421 atggggcacg tatcgtccaa caggagcgta taaaggatca ttttatgctg atggaggcac481 atatgacatt tatgaaacaa cccgtgtcaa tcagccttcc attatcggga tcgcaacctt541 caagcaatat tggagtgtac gtcaaacgaa acgtacaagc ggaacggtct ccgtcagtgc601 gcattttaga aaatgggaaa gcttagggat gccaatgggg aaaatgtatg aaacggcatt661 tactgtagaa ggctaccaaa gcagcggaag tgcaaatgtg atgaccaatc agctgtttat721 tggcaactaa aaaagtcaaa gaaaagagcc gggagcaaaa ctcctggctt tttctatcat781 aatttttcaa cttcgactct gccggaaaag aacgtcgcac caccgcccat atctgccaaa841 cgatcaggtg tgaggccatt caccaaatgt tttttgcctt tttggtctgc ccataatccc901 tgactgacaa caacaccaga taacacattt tgtccgactg acacgatcag ctcgcattct961 cctcgatcat tcagcacacg aaccatgtcc ccatcttcaa tcgtctttct tPrimer 2三：PCR基因扩增及电泳检测：㈠1.按照以下次序，将各成分在0.5mL灭菌离心管中混合：ddH2O 补至终体积（50μL-100μL）10хPCR缓冲液 1/10体积4种 dNTP 各200μmol/LPstⅠ引物 1μmol/LBam HⅠ引物 1μmol/LDNA模板 10ng/μLTaq酶 1-5U混匀，离心15秒，使反应成分集中管底，加50μL石蜡油封住溶液表面。
2.将此微量离心管放入已设置好程序的PCR自动热循环仪，进行扩增。
程序如下：①94℃预变性 2min②94℃变性 30s③52℃退火 1min④72℃延伸 2min⑤重复步骤②-④30次㈡电泳检测:取10μL 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
若在1kb 附近有一条很亮的扩增带，而没有明显的非特异条带，则符合预期结果。
四：DNA重组：1.在灭菌的Eppendorf管中加入pUC19质粒（购买）2μL，10ХK buffer 2μL , Bam HⅠ和Pst Ⅰ各1μL，无菌水14μL，离心混匀，37℃反应3h。
2. 在另一灭菌的Eppendorf管中加入PCR产物6μL，10ХK buffer 1μL, Bam HⅠ和PstⅠ各1μL，无菌水1μL，离心混匀，37℃反应3h。
3.分别将酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc(Ph5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇。
-20℃，2h。
12000 r/min 4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗涤沉淀，再离心，去上清，干燥后，加5μTE缓冲液。
4.将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加入T4 DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，14℃保温14h。
五：E.coli感受态的制备与转化：1.在大肠杆菌JM109平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2.取1mL菌液转接到一个含有50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h。
3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min.4.离心10min（4000r/min），回收细胞。
5.倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。
6.用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮沉淀，立即放冰上保温30min。
7.0-4℃ 4000r/min，离心10min，回收细胞。
8.用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞，（务必放冰上）。
9.取200μL新鲜配制的感受态细胞，加入重组DNA5μL混匀，冰上放置30min。
10.将管放到42℃循环水浴1-2min。
11.冰浴2min。
12.每管加800μL LB液体培养基，37℃培养1h。
13.将适当体积的已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，倒置平皿37℃培养12-16小时，出现菌落。
六：阳性克隆的筛选及酶活检测：㈠阳性克隆的筛选在麦康凯培养基平板上生长的具有氨苄青霉素抗性的白色转化子即为含有外源片段的重组子。
㈡酶活检测挑取白色菌落至5mL LB液体培养基的试管中，37℃慢摇过夜。
取1mL菌液涂在含氨苄青霉素和燕麦木聚糖（ρ=2g/L）的LB选择培养基平板上，生长4小时后，用刚果红（ρ=1g/L）染色30分钟，再用NaCl（ρ=5g/L）脱色30分钟，含有木聚糖酶基因的阳性克隆可产生木聚糖酶，水解菌落周围的木聚糖形成透明的空斑，背景是红色。
空斑的大小可以初步反映酶活的高低。
用0.02mol/L,pH 7.0磷酸缓冲液制备（ρ=10g/L）的溶液，加入适当的稀释酶液，50℃反应30分钟，终止反应后用DNS法测定OD540nm，以木糖作为标准溶液，以每分钟生成1μmol还原糖作为1个酶活单位（1U）。
这样就可以定量测得酶活的高低。
教师点评该实验设计较好地利用了 PCR技术，从细菌染色体基因组中获得木聚糖酶基因。
但是PCR引物的设计还有些问题，pUC19本身有ATG起始密码子，ATG,CCT,GCA,GAG,GAG,AGG,AAT,GAC,GAA,TGA（下划线部分为引物的PstI酶切位点，前面是载体PstI酶切位点前面的序列，灰色底纹为目的基因的起始密码子），在外源基因插入表达时，读码框架发生改变，引起移码突变。
对阳性克隆的筛选注意到利用木糖酶本身特有的一些酶学特征与性质，将其与传统的阳性克隆筛选方法结合起来，更有利于快速准确地检测出重组基因质粒。