水体总细菌计数

在 30-80 的Biblioteka Baidu释度计数，在该稀释度中选取 10 个视野，记录荧光点数，一个点 代表一个菌。 （ 8 ）原菌体浓度 E 计算： E X
S1 v1 V N ，其中 X 表示平均视 S2 v 2
野菌数，是 10 个视野中荧光点数的平均值，S1 表示磨面积，等于 D2π/4,其中 D 表示膜直径，为 25mm，S2 表示视野面积,等于 d2π/4,其中 d 为显微镜视野直径， 为 0.22mm ； v1 、 v2 分 别 表 示 原 菌 液 （ 4mL ） 和 固 定 后 菌 液 体 积 （4mL+0.160mL）,v1/v2 表示过滤的稀释液中原菌液比例；V 表示过滤的稀释菌 液的体积，为 9mL；N 表示稀释倍数。 实验中所有试剂，蒸馏水均经过 0.22μm 的微孔过滤，实验所用的过滤器， 无菌水，注射器，7mL 离心管，枪头等均灭菌后使用。
水体总细菌计数方法：AODC 计数
最早由 Francisco 等采用该方法计数自然水体中的细菌总数，从而确定了该 方法的基本程序 （Francisco et al., 1973） ， 后经由 Hobbie 等人 （Hobbie et al., 1977 ） 改进形成经典的计数方式而推广。国内目前主要用于水生环境中细菌的计数，有 外文文献报道用该法富集硝化细菌的富集（Ågot Aakrået al., 1999），尚未发现 将该法用于硝化细菌分离的实验。郑忠辉 1992 年在 《亚硝酸氧化细菌分离方法 的比较》 一文中提到稀释法成功分离到硝化细菌， 参照该实验方法， 利用 AODC 技术方法取代传统的细菌计数进行硝化细菌的分离。本实验主要依据 chwinghamer 的操作,采用 0.22µm 的纤维素微孔滤膜拦截细菌，截留率可以达到 90%以上 （chwinghamer, 1988 ） 。 实验中将低压真空泵更换成手动的玻璃过滤器， 操作更方便。具体实验参数由预实验操作确定，最终确定的操作步骤如下： （1）取样：无菌操作条件下，准确吸取 4mL 的富集培养液于灭菌烘干的 7mL 离心管内，盖紧盖子。 （2）振荡：将离心管固定在振荡器上，振荡 10min,使菌体充分打散。 （3）固定：加入 40%甲醛 0.160mL，混合均匀，固定 1-2min。 （4）梯度稀释：9mL 无菌水进行 10 倍数梯度稀释，确定稀释后液体量为 9mL。 （5）染色：加入 1g/L 的吖啶橙 0.9mL，控制吖啶橙的终浓度约 0.01%，染 色时间 7min。 （6）过滤：旋开无菌的一次性过滤器（直径 25mm） ，在过滤器滤层上加盖 一片直径 25mm，孔径 0.45μm 的微孔滤膜（保证 0.22μm 膜的平整性） ，再在膜 上放置一片直径 25mm， 孔径 0.22μm 经 2g/L 苏丹黑 4℃浸泡 16-24h 的微孔滤膜 （苏丹黑浸泡以去除微孔滤膜本身的自发荧光） ，旋紧后，标记，用过滤器吸取 染色后液体，微孔过滤，使菌体截留在 0.22μm 的苏丹黑溶液处理的膜上，蒸馏 水 3mL 洗涤染色液 PA 瓶，洗涤液依然微孔过滤。 （7）镜检观察： 干净的载玻片上滴加一滴松柏油， 将 0.22μm 的微孔滤膜转 移到玻片上， 加盖松柏油， 再加盖干净的盖玻片， 保证膜与盖玻片间无气泡， 100x 油镜下找到界面， 转换荧光显微镜微调至细菌荧光清晰界面观察，选取荧光点数