发酵工程菌种的来源
2023版高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程第35课传统发酵技术的应用发酵工程及其应用教师用
第35课 传统发酵技术的应用 发酵工程及其应用►学业质量水平要求◄1．结合泡菜的制作，科学认识生活中用到的生物学知识。
(生命观念、科学探究)2．通过果酒和果醋的制作，认识不同类型微生物的应用，并根据各自的特点理解其操作过程。
(生命观念、科学思维)3．结合生活或生产实例，举例说出发酵工程的原理并进行简单的设计和制作。
(生命观念、科学探究)考点一 传统发酵技术的应用1．发酵与传统发酵技术(1)发酵①概念：发酵是人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
②实例——腐乳 a ．原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸。
b ．起主要作用的微生物：毛霉。
(2)传统发酵技术①概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
②类型：以混合菌种的固体发酵和半固体发酵为主。
2．传统发酵食品的制作(1)泡菜的制作①菌种来源：附着在植物体表面上的乳酸菌，常见种类有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
②原理：乳酸菌的无氧呼吸，反应简式为C 6H 12O 6――→酶2C 3H 6O 3(乳酸)＋能量。
③制作过程(2)果酒和果醋的制作①制作原理与发酵条件②制作过程1．乳酸菌是厌氧细菌，无氧呼吸产物是乳酸与CO2。
( ×) 2．亚硝酸盐会危害人体健康，一定要禁止食用。
( ×) 3．葡萄酒的自然发酵中，起主要作用的是突变型酵母菌。
( ×) 4．只要O2充足醋酸菌发酵的产物是一样的。
( ×) 5．制作泡菜过程中可在坛内加入少量白酒，防止泡菜变质。
( √) 【教材细节命题】1．(选择性必修3 P6探究·实践)为什么泡菜坛只能装八成满？在泡菜发酵初期，由蔬菜表面带入的大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，它们可进行发酵，发酵产物中有较多的CO2，如果泡菜坛装得太满，发酵液可能会溢出坛外。
发酵工程菌种的来源及选育
细菌分离：以乳酸菌为例
放线菌的分离
(一)采样
菜园土或林地土
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。 可以筛选新的放线菌。
从堆肥或过热的材料中如干 草或蔗渣中可分离到大量的嗜热 放线菌，从淡水和海洋环境中分 离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
自然风干，备用
气生孢子能耐干燥，耐湿热能力 高于营养体，室温保存20天， 放线菌的数量和组成变化不大， 细菌大部分死亡。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、
地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
发酵工程(菌种选育)重点
某些化学诱变剂常用浓度及处理时间
诱变剂 二乙酯 浓度 0.1～1% 处理时间(min) 18～24 60～120 中止方法
硫代硫酸钠或稀释 大量稀释
亚硝基胍 0.1～3㎎/ml
4）突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌 株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这
需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真
在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然
突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。
2.自然突变的两种可能
菌种衰退，生产能力下降；
代谢更加旺盛，生产性能提高。 3.自然选育的方法——单菌落纯种分离
五、诱变育种（Mutation breeding）
1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或 化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、
诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、γ-射线、X-射线、
快中子、激光、等离子体、高压等
化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝
酸、碱基类、吖啶类物质等
诱变剂量的选择：
一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，
因此，通常诱变剂量采用致死率90%～99%的剂量， 但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低 得多（致死率在90%～99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这 种处理方法通常较单一处理的效果好。
菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106～107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。
(整理)发酵工程 -单选1
1、关于菌种的选育不正确的是（C）A、自然选育细胞不经过人工处理B、诱变育种的基础是基因突变C、通过有性杂交可形成工程细胞D、可构建基因工程菌2、糖类和脂肪都可以作碳源使用，但糖类和脂肪相比，微生物在代谢时需要（B）的溶解氧。
A、较多B、较少C、相等D、不确定3、营养缺陷型菌株是发酵菌种的来源之一，这是一种（C ）。
A、营养不良症的菌株B、在完全培养基上不能生长的菌株C、不能合成部分营养因子的菌株D、营养成分缺少时获得的菌株4、淀粉在水介质中,通过用化学试剂或升温等方法使淀粉发生膨胀和胶状扩散而形成的粘性物质的过程，称之为（A ）。
A、糊化B、胶凝化C、老化D、糖化5、酵母菌发酵需要一定浓度的葡萄糖，但当培养基中葡萄糖浓度过高时反而会抑制菌体的生长，其原因是（D）。
A、分解代谢阻遏B、细胞质壁分离C、细胞通透性减少D、Crabtree效应6、关于青霉素生产的叙述，正确的是（B）。
A．青霉素是青霉菌生长代谢中重要的初级代谢产物B．用紫外线、激光、化学诱变剂处理青霉菌再经筛选的方法可以选育高产菌种C．发酵罐接种后必须进行灭菌处理后发酵D．在青霉菌生长的稳定期，活菌数不再增加，青霉菌产量也不再增加7、有关谷氨酸棒杆菌的生长和谷氨酸发酵的叙述，错误的是（B）。
A、组成酶是维持菌体基本代谢的必要条件B、谷氨酸棒杆菌是全基因型菌体，不需要从外界补充生长因子C、发酵液pH呈酸性时，就会生成乙酰谷氨酰胺D、细胞膜透性的改变，可解除代谢产物对有关酶活性的抑制8、酿酒酵母厌氧发酵产生CO2的摩尔数为N，在好氧情况下，消耗同样数量的葡萄糖可以产生的CO2量是（B）。
A、1/3N molB、3N molC、6N molD、12N mol9、灭菌常数K值反映了微生物在一定条件下的（B ）。
A、耐热温度B、耐热时间C、传热能力D、比热10、一发酵罐内有100立方米的培养基，121℃实罐灭菌，设耐热芽孢杆菌为107个/毫升培养基,该菌的耐热系数为0.02303s-，则按对数残留定律求灭菌失败机率为10-3时所需的灭菌时间为（C）。
4、第1章 第3节 发酵工程及其应用 讲义
第3节发酵工程及其应用一、发酵工程的基本环节发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面。
1．选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
2．扩大培养：工业发酵罐的体积很大，接入的菌种总体积也较大，因此在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。
3．配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。
培养基的配方要经过反复试验才能确定。
4．灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。
一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。
因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
5．接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。
大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。
6．发酵罐内发酵：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。
还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
7．分离、提纯产物：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。
如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
二、发酵工程的应用1．在食品工业上的应用(1)生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。
(2)生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。
(3)生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
2．在医药工业上的应用基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
3．在农牧业上的应用(1)生产微生物肥料。
微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
(2)生产微生物农药。
微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
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2018年11月26日星期一
吉林师范大学生命科学学院
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人工诱变 的菌株不 能合成 反 馈 抑
高丝氨酸脱氢酶
不能合成
可以大量 积累
制
2018年11月26日星期一
人工诱变控制黄色短杆菌 吉林师范大学生命科学学院 的代谢过程生产赖氨酸P459
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氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚； 代谢途径比较简单。 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌。 其它氨基酸生产菌：常规菌种一般是以谷氨酸生产菌选 育而成；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌， 工程菌。
2018年11月26日星期一
吉林师范大学生命科学学院
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对微生物的作用不同
通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性 物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机 体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某 个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发 生突变或死亡，是一种基本代谢类型。 次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能，不 参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，不是机体生长 与繁殖所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生 障碍，也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响 机体合成某种次级代谢产物的能力。但许多次级代谢产物 通常对人类和国民经济的发展有重大影响
2018年11月26日星期一 吉林师范大学生命科学学院 13
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§2 自然界中目的微生物的分离
一、菌种分离的一般过程 二、微生物材料的标本采集 A、不同的土壤特点 B、地理和气候条件 C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离 三、标本的预处理 四、目的微生物富集的一些基本方法
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概念不同
在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外 界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成 代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过 程，称为初级代谢 而次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个 概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一 定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合 成一些对微生物的生命活动无明确功能的物 质的过程
五、菌种分离
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一、菌种分离的一般过程 P14
标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛） → 发酵性能鉴定 → 菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大？ 如何在后续的操作中使这种可能性实现？
能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；
遗传性能要相对稳定；
菌种改造的可操作性要强；
抗噬菌体及杂菌污染能力强；
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好 与致病菌无关）；
发酵条件如温度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。
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存在范围不同
初级代谢的代谢系统、代谢途径和代谢产物 在各类生物中都基本相同，它是一类普遍存 在于各类微生物中的一种基本代谢类型。< 次级代谢只存在于某些微生物中，并且代谢 途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同 种生物也会由于培养条件不同而产生不同的 次级代谢产物。
初级代谢和次级代谢异同？
1 概念不同 2 产物不同 3 存在范围不同 4 对微生物的作用不同 5 同微生物生长过程的关系 6 对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明 显不同 7 相关酶的专一性不同 8 两者既有区别性又有连续性
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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内容速览
2.2目的微生 物的分离 2.1工业化 菌种的要 求及介绍 1自然 选育
2.4 种子扩大培养
2.3菌 种选育
2诱变 育种
2
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§1 工业化菌种的要求及
已工业化产品生产菌介绍
一、工业化菌种的要求
二、已工业化产品生产菌介绍
1、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素、四 环素、红霉素等） 真菌（青霉素、头孢菌素等）
一些产芽孢的细菌（多 黏菌素、丁胺菌素等） 植物或动物来源（蒜素、番 茄素、鱼素等）
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第二章 菌种的来源(4学时)
教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生
产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注 意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本 特性和菌种的选育、种子扩大培养。
教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、
地理和气候条件，土样的采集方法； 生化反应分离法；种 子扩大培养。
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产物不同
初级代谢的产物，即为初级代谢产物。如单 糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、 脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子 聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生 命必需物质。< 通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物， 大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其 作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、 毒素等类型
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2、氨基酸生产有关的微生物
50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵， 是发酵工业发展历史上的一个转折点。
代谢控 制发酵
用人工诱变的方法，有意识地改变微生物 的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵
形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵 中得到成功应用。
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3、酶制剂生产有关的微生物
利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉 通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始 于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α —淀粉酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌等； β-淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等； 纤维素酶：木霉、青霉； 蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌等。