HIV-1中和抗体检测方法的建立
HIV抗体检测实验操作规程
HIV抗体检测实验操作规程
1.检测试剂：初筛用的HIV抗体检测试剂，必须是HIV-1/2混合型，经卫生部批
准或注册，经过批检合格，并在有效期内。
常用的检测方法有固相酶联免疫吸附实验，颗粒凝集和其他快速诊断等方法。
2.检测要点
严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。
注意防止交叉感染。
严格遵守实验室操作规程。
1.初筛检测程序
(1)血液标本验收合格后，用初筛检测试剂进行检测，如呈阴性反应，则做
HIV抗体阴性报告。
(2)初筛检测结果呈阳性反应的标本，需进行重复检测。
复检时用原有试剂
和不同原理的另外一种试剂或不同厂家的初筛检测试剂复检。
(3)如两种试剂复检均呈阴性反应，则作HIV抗体阴性报告；如均呈阳性反
应，或有一份阳性，该标本需送上级实验室加以进一步证实。
送检时应准确填报复检单，重新抽血连同原血专人送省疾控做HIV-Ab确证实验。
编写：审核：批准：。
爱滋检测方法和步骤
微孔板1包8* 12T
酶标抗原1瓶14ml
阳性对照1瓶1 ml
阴性对照1瓶1 ml
洗涤液2瓶25 ml
显色剂A 1瓶7 ml
显色剂B 1瓶7 ml
终止液1瓶7 ml
说明书1份
自封袋1个
封板膜3张
样品的采集和保存：
1．采集静脉的血清血浆样本应在无菌条件下保存，并避免样品溶血及反复冻溶。
2．血清和血浆样品收集后如果无法在当天检测，样品须在（2-8℃）保存；如果大于7天则需冷冻保存。
辽宁省丹东市
传染病医院检验科
作业指导书
第十七节人类免疫缺陷病毒标准操作规程
文件编号：SH-SOP-017
版本：2006-07
生效日期：2006-07-01
珠海丽珠试剂（双抗原夹心酶联免疫法）检测HIV抗体
实验原理
本品用钝化基因工程人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗原宝贝的微孔板和酶标记的HIV-1/HIV-2抗原及其它试剂组成，应用双抗原夹心法原理检测人血清或血浆中HIV-1/HIV-2抗体，适用于献血员筛查及临床HIV抗体检测。
版本：2006-07
生效日期：2006-07-01
9.显色：每孔加入显色剂A B液各50vl，轻轻震荡混匀。37±1℃避光显色15±1分钟。
10.测定：每孔加终止液50vl，轻轻震荡混匀。设定酶标仪波长于450nm处。测定各孔A值。
结果判定：1.阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值≤0.10。
4.加样时必须用加样器加，并经常校对加样器的准确性。
5.洗涤时各空均需加满洗液，防止空口内有游离酶不能洗净。使用洗扳机洗涤应设定30-60秒浸泡时间。
6. HIV抗体检测结果的判定必须以酶标仪读数为准。用双波长检测时，参考波长可用600-650nm。
HIV初筛实验室标准操作规程
HIV初筛实验室标准操作规程人类免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗体酶联免疫原理和方法（上海科华生物）原理：用HIV-1+2型抗原包被酶联板。
待检血清或血浆中的抗-HIV抗体与包被抗原反应，再与酶标HIV-1+2型抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物。
加底物（TMB）显色，在酶标仪上测定后根据OD值判定有无HIV抗体的存在。
操作步骤：1、取出HIV抗原包被板。
每次试验设空白对照1孔，阴性对照各1孔，阳性对照各3孔（其中阳性对照1两孔，阳性对照2一孔），质控一孔。
分别加入HIV阴、阳性对照质控血清各100微升，其余孔加入待检样本各100微升。
贴上封口胶，置37℃温育60分钟。
2、将浓缩洗液用纯化水25倍稀释后洗涤用。
3、弃去各孔中样品、拍干。
每孔加满洗液，静置数秒后弃去，如此重复洗5次，拍干。
4、每孔加入酶标抗原工作液100微升，贴上封口胶。
37℃温育30分钟。
5、弃去各孔中酶液，用洗液反复洗涤5次（操作同步骤3）。
6、每孔加入底物液A50微升，再加入底物液B50微升，轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟。
7、显色完毕后，每孔加入终止液50微升，轻拍混匀，置酶标仪450nm波长处测定OD值（参考波长为630nm）。
结果判定：阴、阳性对照和被检样本的OD值减去空白对照OD值即为计算值。
2、若阴性对照OD均值小于0.02按0.02计算。
3、临界值（cut off 值）的设定：cutoff值= PC x×10%（若PC x>=2.5按2.5算）4、被检样本的OD值≥临界值应判为HIV抗体阳性反应，<临界值为阴性反应。
检测样本的OD值≥临界值判为HIV抗体阳性，应重新取样双孔复试，复试阳性者应按照“全国HIV检测管理规范”送“HIV确认实验室”进行确认实验。
注意事项：1、本试剂的使用单位必须是当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。
2、整个HIV检测必须符合《全国艾滋病检测工作规范》严格防止交叉感染。
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体是指可以结合病原体并防止其进入宿主细胞或抑制其复
制的抗体。
中和抗体检测主要通过体外细胞培养或动物实验的方式进行。
1. 细胞培养法检测中和抗体
细胞培养法检测中和抗体主要包括细胞防御性中和试验、对中和
抗体的小胶片半微量滴度试验和复合病原体细胞培养中和试验。
其中，细胞防御性中和试验是最常用的方法。
该方法使用细胞系于体外培养，将病原体与中和抗体一起加入培养基内，观察病原体在细胞内是否被
清除，从而判断中和抗体的效力。
2. 动物实验法检测中和抗体
动物实验法检测中和抗体是通过注射病原体，将中和抗体加入动
物体内，观察病原体在动物体内的复制能力，从而判断中和抗体的效力。
常用的动物实验包括小鼠腹腔注射法、兔子狂犬病中和抗体测定
法等。
以上方法主要依靠病原体的复制和细胞的防御能力进行判断，从
而确定中和抗体的效力。
该方法有很高的可靠性和准确性，可广泛应
用于病毒、细菌和其他病原体等的检测中。
HIV抗体检测的标准操作程序（ELISA法和快速法）
HIV测定（ELISA法）标准操作规程1、检验目的应用双抗原夹心酶联免疫法原理（ELISA）定性检测人血清、血浆标本中的HIV（1+2）型抗体的测定，用于HIV感染的辅助诊断，抗HIV药物治疗的效果的监测。
2、原理采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV （1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。
通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。
3、性能参数灵敏度高（0.5ng/ml）4、标本要求（1）标本类型：血清，血浆。
（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，2-8℃不超过72小时，-20℃可长期保存，应避免反复冻融（4）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
本文来自检验地带网5、容器和添加剂类型6、试剂（1）试剂名称：人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒。
（2）试剂生产厂家：上海科华生物工程股份有限公司（3）包装规格：96T/Kit（4）试剂盒组成：①、HIV酶标板；②、HIV酶标试剂；③、HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；④、显色剂A液和B液；⑤、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。
7、仪器设备：酶标仪：ZS板式，北京普朗生物技术有限公司，每年由计量单位进行一次校准。
洗板机：DNM-9620型，北京普朗生物技术有限公司，每年由国家计量单位进行一次校准。
移液器：上海求精，每年由国家计量单位进行一次校准。
8、校准程序9、操作步骤①、配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。
②、编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。
③、加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。
病毒中和试验以HIV为例介绍
病毒中和试验1.介绍病毒不同亚型特异的抗体能够结合病毒表面蛋白特定的表位，从而中和病毒的感染能力。
经典的中和作用指抗体结合到病毒表面从而阻止其感染敏感细胞。
病毒中和试验的确切机制还不是很清楚。
中和作用不是简单地抗体包被病毒颗粒，或者是阻断对敏感细胞的吸附。
阻断作用可发生在吸附和侵入之后的任何阶段。
对流感病毒中和试验显示：特定的单克隆抗体阻断作用并不是发生在吸附，侵入，脱壳或者病毒基因进入细胞核的过程，这一现象充分说明了病毒中和所用的复杂性。
1.1抗体中和作用遵循的一些原则最直接检测和定量中和抗体的方法是通过测定病毒对敏感细胞感染力的减少。
感染力的抑制可以粗略的分为“quantal”试验（即全或无,可翻译为定性实验）和定量试验。
quantal实验判断结果为感染是否发生。
相对于测定有感染力的病毒颗粒数目的定量试验，quantal实验的结果是感染力的“全或无”，结果没有定量实验结果准确。
采用终点法有一系列的方法用来衡量病毒感染敏感细胞。
感染的指标可通过以下：CPE，病毒蛋白的免疫印迹和病毒导致细胞死亡的一些非特异的化学方法如[3H]胸腺嘧啶的合并或者四甲基偶氮唑盐导致的颜色改变。
在定性实验中，每个病毒颗粒在敏感细胞中增殖，形成局部灶性病变.可通过培养几天后出现CPE 来观察。
经典的定量试验是空斑形成实验，适当的细胞贴壁后，病毒吸附，软琼脂或琼脂覆盖(使病毒的增殖限制在最初感染的细胞的周围。
)为了使形成的蚀斑更明显易于肉眼观察，单层细胞通常需要染色如中性红，活细胞能够被染色，而蚀斑在红色背景下很明显。
一些疱疹病毒和痘病毒可以在液体环境中的单层细胞中形成蚀斑，因为大部分病毒是在细胞内的，蚀斑的形成是病毒通过细胞间接触感染临近细胞形成的。
这里以介绍HIV——艾滋病的致病原为例介绍中和试验的方法。
这种方法也可适用于其他的病毒。
2.材料，细胞系，和培养基CD4+T细胞，如H9，MT4或者C8166，采用含10%的胎牛血清的RPMI1640。
假病毒中和抗体检测方法及实验步骤
假病毒中和抗体检测方法及实验步骤假病毒中和抗体检测是一种用于识别和定量特定的抗原或免疫球蛋白的免疫学组化技术。
它可以帮助识别和定量特定的蛋白，用于诊断各种不同的感染、免疫性或遗传性问题。
检测中和抗体的方法：在很多早期中和抗体的研究中使用实验室分离毒株、T细胞系和来自感染者的血清。
多数情况下，使用T细胞适应病毒和T细胞系比使用原代分离病毒和PBMC更容易观察到病毒中和作用。
重要的是，要复制体内的情况，有必要使用同源的原始病毒分离株和正常PBMC来测量中和抗体。
这些检测方法中的成分使这方法最接近开展具临床意义的体内HIV中和潜能的检测。
目前尚未正式定义原始分离株，但它通常指PBMC中复制的不超过3代，且通常自最初分离出不超过2个月的病毒。
一些研究者建议使用未刺激的PBMC进行中和实验，因为体内细胞可能是未活化的。
鉴于未活化的细胞可以表达不同的病毒辅助受体，此种检测方法有待进一步研究。
近来的检测中多采用重组病毒技术和单周期病毒检测法，能检测到更高水平的中和抗体。
但这些分析的临床意义有待评估。
例如，最近研究表明HIV包膜假病毒与有同样的包膜糖蛋白的感染性HIV分子表现出相似的中和敏感性。
然而，在PBMC中培养感染性分子克隆的中和敏感性却下降，此结果可能表明，PBMC中培养的病毒表面的包膜蛋白增加。
此观察表明，这些较快速的中和抗体检测明显具有临床意义。
尽管如此，这些区别是定量的而不是定性的，包膜假病毒与HIV-1原始分离株的中和敏感性相似。
重要的是，随着疾病进展，中和抗体可以被增强抗体所取代。
最近，一些病毒和方法已被推荐用来检测中和抗体反应，尤其是由疫苗诱导的中和抗体。
假病毒中和抗体检测的步骤如下：1.将样本中的血浆或血小板进行分裂；2.将样本中得到的血小板与所需要测量的特异性IgG/IgM/IgA连合；3.添加适当量的真核表达载体（例如pCMV-HA-VLP）并将其加到另一个板上；4.在冷冻条件下将真核表达载体/特异性IgG/IgM/IgA复合物固定在另一个板上。
新型HIV-1核酸定量内标构建及验证
ｂ ａ ｓ ｅ ｂ ｙ Ｇａ ｔ ｅ ｗａ ｙ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ． Ｔ ｈ ｉ ｓ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ ＶＳ Ｖ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ２ ９ ３ Ｔ
Ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｂ ｅ ｏ ＇ ｉ ｎ ｇ Ｙ ｏ ｕ ＂ ａ ｎ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｃ ａ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｂ ｅ ｏ ＇ ｉ ｎ ｇ１ ０ ０ ０ ６ ９ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
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段：获得仅具有１ 次感 染 性 的Ｈ Ｉ Ｖ － １ 假病毒颗粒 （ ３ ． ６ １×１ ０ Ｉ Ｕ ／ ｍ１ ） ；ｐ ２ ４ 抗 原检 测 含 量 为 ２ ８ ３ ． ２ ｐ ｇ ／ ｍｌ ；
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万方数据
中国生物制品学杂志２００８年９Ｙ］第２１卷第９期ＣｈｉｎＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＳｅｐｔｅｍｂｅｒ２００８。
Ｖ０１．２１Ｎｏ．９．８１１．
１．２试剂
ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清和转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃ—ｔａｍｉｎｅ２０００均购自美国ＧＩＢＣＯ公司；ＨＩＶ．１阳性血清分离自广西艾滋病患者；碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ购自ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ购自福建迈新生物技术公司。
１．３细胞培养和转染
于转染前一天将２．５Ｘ１０５个２９３Ｔ细胞接种于６孔板，至第２天达７０％一８０％单层时，将质粒ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ（９¨ｇ）分别与带有ＨＩＶ．１Ｅｎｖｅｌｏｐｅ基因的真核表达质粒ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ亚型（１斗ｇ）和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ亚型（１斗ｇ）共转染２９３Ｔ细胞，两种质粒按９：１摩尔比稀释于２５０Ｉｘｌ无血清无抗性ＤＭＥＭ溶液中，温和混匀；用前混匀Ｌｉｐｏ—ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，取６Ｉｘｌ溶于无血清无抗性ＤＭＥＭ，温和混匀，室温作用５ｍｉｎ；将上述两种溶液混匀，室温作用２０ｒａｉｎ；加入细胞培养液内，混匀，置３７℃５％ＣＯ：培养箱中培养４８ｈ。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测目的基因在２９３Ｔ细胞中的表达，同时检测荧光素酶含量。
１．４假病毒感染
转染４８ｈ后，收集瞬时转染的细胞培养上清，３０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，用Ｏ．４５¨ｍ滤器去除细胞残渣，获得ＨＩＶ．１假病毒。
将靶细胞ＨＯＳ．ＣＤ舡ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４接种６孔板，８×１０４个／孔，３７℃５％Ｃ０２培养２４ｈ，每孔加入２００山假病毒，置３７℃５％ＣＯ：细胞培养箱孵育ｌｈ；再向各孔中加入ＤＥＡＥ，终浓度１７ＶＬｇ／ｍｌ，置３７℃细胞培养箱培养５ｈ后，向各孔中补加无抗性完全ＤＭＥＭ培养基，至终体积为ＩＩｎｌ，培养７２ｈ后裂解细胞，检测荧光素酶含量。
１．５ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔ检测
收集感染后的细胞，进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，加入ＰＢＳ溶解的３％脱脂奶粉，室温封闭ｌｈ；用ＰＢｓＴ（Ｔｗｅｅｎ．２０终浓度为ｏ．２％）洗涤１次，５ｍｉｎ／次；加入含ＨＩＶ－１阳性血清的ＰＢＳ（含ｌ％脱脂奶粉），振摇１．５ｈ；用ＰＢｓＴ洗膜３次，５ｍｉｎ／次；加入含碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ的ＰＢＳ（含ｌ％脱脂奶粉），振摇３０—４５Ｉｌｌｉｎ；用ＰＢＳＴ洗膜３次，５ｒａｉｎ／次；用ＰＢＳ洗涤１次；取６６¨ｌＮＢＴ和３３斗ｌＢＣＩＰ溶液，与１０Ｉｎｌ碱性磷酸酶缓冲液混匀，浸泡膜显色。
１．６荧光素酶检测
吸弃待检细胞培养基，用ＰＢＳ漂洗细胞２—３次；加入１×裂解缓冲液覆盖细胞；将细胞从培养皿刮下，漩涡振荡５—１０ｓ，１２０００ｇ离心１５ｓ（室温）；取上清液８０仙ｌ，加入荧光仪器专用检测板中，并加平衡至室温的荧光反应底物，３０斗ｌ／孔，仪器读数检测荧光素酶含量（样品须在２０ｍｉｎ内检测，否则影响酶活力；暂时不测的样品保存于－８０℃）。
１．７统计学分析
实验数据应用统计学软件ＳＰＳＳＩＯ．０进行统计学分析，样本显著性分析用配对ｔ检验。
２．结果
２．１目的蛋白在２９３Ｔ细胞中的表达
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，共转染质粒ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ与ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ与ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ的２９３Ｔ细胞均有ＨＩＶ．１结构蛋白Ｇ／ｌｇ：ｐｏｌ和Ｅｎｖ的表达，相对分子质量分别为５５０００和１６００００；而单独转染ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ及ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ＋ＶＲｌ０１２质粒的细胞只有结构蛋白Ｇａ９１）ｏｌ的表达，见图１。
ｌ：ｐｒ岫ｍａｒｋｅｒ；２：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｇ．Ｒ．Ｅ＋ｐｃＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ；３：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ４－ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ；４：ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；５：ｐＮＩＡ－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ＋ＶＲｌ０１２；６：ｐＮＩＡ－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｉｌ图１目的蛋白在２９３Ｔ细胞中表达的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测№１．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｎ２９３Ｔｃｅｌｌｓ
２．２转染的２９３Ｔ细胞荧光素酶含量
将表达荧光素酶的ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ质粒单独转染或与表达Ｅｎｖ基因的质粒共转染２９３Ｔ细胞后，均有很强的荧光素酶的表达。
ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ共转染组和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ共转染组与空白对照组（２９３Ｔ细胞）相比，其荧光素酶表达强度均显著升高（ｔｌ－１．５７０，ｔ２＝１．１８９，Ｐ均小于０．０１），见图２。
２．３假病毒感染ＨｏＳ－ＣＤ４·ＣＣＩ巧／ＣＸＣＲ４细胞后的荧光素酶含量
结果表明，ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ和ｐｃＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ以及ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｅ．Ｒ．Ｅ和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ共转
染后的细胞上清均能检测到荧光素酶表达，证明荧
万方数据
万方数据
HIV-1中和抗体检测方法的建立
作者：赵东海， 张喜珍， 马红霞， 孔维， 于湘晖
作者单位：赵东海(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫苗研究中心,长春,130021;吉林医药学院病理学教研室,吉林,132013)， 张喜珍,马红霞,孔维,于湘晖(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫
苗研究中心,长春,130021)
刊名：
中国生物制品学杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS
年，卷(期)：2008,21(9)
1.Ferrantelli F.Rasmussen RA.Hofmann-Lehman R Do not underestimate the power of antibodies21essons from adoptive transfer of antibodies against HIV 2002(06)
2.黑发欣.邵一鸣HIV中和抗体的免疫机制、诱导和检测[期刊论文]-国外医学(病毒学分册) 2004(01)
3.马红霞.于湘晖.姜春来中国流行株HIV-B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2006(04)
4.Mascola JR.Louder Mk.Winter C Human immunodeficiency virus type 1 neutralization measured by flow cytometric quantitation of single-round infection of primary human T ceils[外文期刊] 2002(10)
本文链接：/Periodical_zgswzpxzz200809025.aspx。