微生物实验-细菌的人工培养及形态学检查
微生物形态学检验-PPT
➢ 培养特性：在沙氏培养基或营养琼脂上培养5-7日 可见菌落，菌落表面有皱折、呈颗粒状、黄色或深 橙色；在血琼脂平板上菌落较小、凸起、呈白色
肠杆菌科 Enterobacteriaceae
➢ 基本特征：在血琼脂平板上生长，在麦康凯、伊红 亚甲蓝、中国蓝琼脂平板上形成发酵和不发酵乳糖 的菌落；在三糖铁或克氏双糖底层、上层产酸、产 气、氧化酶试验阴性
伤寒沙门氏菌 S.typhi
➢ 形态与染色：革兰阴性杆菌，菌体细长，有周鞭毛
➢ 培养特性：在麦康凯上形成无色、透明菌落，SS平 板上呈无色、透明菌落、但大部分菌落中央呈黑色
肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae
➢ 形态与染色：革兰阴性杆菌，单个、成双或短链排 列，荚膜染色可见外周有透明、环状荚膜
细菌分离培养及鉴定
➢ 细菌分离培养：使细菌在平板上分散生长，便 于观察菌落特征，也易于挑取单个菌落进行生 化鉴定或血清学试验
➢ 细菌鉴定：形态与培养特性：形态、染色、培 养特性和菌落特征是鉴定细菌的初步依据
细菌形态与染色特点
➢ 染色性：革兰阳性、阴性，抗酸染色阳性、阴性等 ➢ 形状、大小和排列：球菌、杆菌、螺形菌，菌体大小、
荧光假单胞菌 P.fluorescens
➢ 形态与染色：阴性杆菌、无芽孢、无荚膜、端鞭毛 ➢ 培养特性：在麦康凯上呈无色半透明菌落，在营养
琼脂上形成荧光色的菌落
恶臭假单胞菌 P.putida
➢ 形态与染色：阴性杆菌、无芽孢、无荚膜、极端鞭毛 ➢ 培养特性：在麦康凯上呈较大无色、湿润菌落，在营
养琼脂上形成黄绿色菌落，紫外线下可见荧光
炭疽芽孢杆菌 B.anthracis
➢ 形态与染色：为致病细菌中最大的革兰阳性杆菌， 两端截平，体外培养后形成长链，排列呈竹节形。 在体内常单个存在或短链，有荚膜，在人工培养基 上可见芽孢，卵圆形并位于菌体中央，菌体不膨大
接种环灭菌
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③分析细菌致病性。
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（二）革兰染色法
3. 步骤 涂片－→干燥－→固定－→染色
★涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布 ★干燥：自然干燥或热空气干燥 ★固定：通过火焰外焰三次
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★染色：初染、媒染、脱色、复染 ★镜检
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染色方法
影响革兰染色的关键步骤是脱色
1分钟
结晶紫
卢戈碘液 1分钟95％酒精 30S～1min 稀释复红
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三、实验方法与结果 1. 培养基的制备过程和常用培养基的种类 培养基的制备过程：一般培养基的制备过程须以下步骤
准确称量培养基各成分、混合溶解、测定及矫正pH值、 分装、包装、灭菌、质量检1查7 、保存。
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（2）常用培养基的种类：根据不同细菌的营养要求
物理性状及用途进行分类
按物理性状分类：固体培养基、半固体培养基、液体培养基 按用途分类：培养基按用途可分为基础培养基、营养培养基
初染 水洗
媒染 水洗
脱色
水洗
复染
水洗
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干燥
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（三）细菌的基本形态的观察
（1）球菌：葡萄球菌，革兰阳性（紫色），呈葡萄串状 排列。
（2）杆菌：大肠埃希菌，革兰阴性（红色），两端钝圆， 排列无一定规律。
（3）弧菌：霍乱弧菌，革兰阴性（红色），菌体弯曲呈
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弧形，排列无一定规律。
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（四）细菌特殊结构的观察
一、实验目的
掌握 光学显微镜油镜的使用方法及保护 掌握 革兰染色的原理及操作方法 熟悉 球菌、杆菌、螺形菌三种细菌的基本形态
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熟悉 鞭毛、荚膜、芽胞等细菌特殊结构
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二、实验准备
细菌的人工培养实验报告
细菌的人工培养实验报告实验室报告
实验名称：细菌的人工培养
实验目的：
1. 了解细菌的形态特征和生长条件；
2. 掌握常用的细菌培养基和培养方法；
3. 学习如何观察和分离细菌。
实验器材：
1. 培养箱；
2. 细菌培养基；
3. 水槽；
4. 移液管；
5. 火柴或酒精灯；
6. 消毒剂等。
实验步骤及记录：
1. 准备培养箱和培养基：先用蒸馏水清洗好培养箱，在箱内加入细菌培养基，且保持无菌状态。
2. 采集样品：将样品（如口腔拭子、洗手液等）用消毒剂消毒后，用移液管采集约1ml样品并加入到培养基中。
3. 混合样品：用移液管轻轻将样品和培养基混合均匀。
4. 感染培养基：用火柴或酒精灯将移液管加热至红热，在无菌环境下用移液管将液体滴入培养基中。
5. 储存细菌培养基：将培养好的细菌培养基储存在恒温培养箱内，温度一般为37℃，时间依据细菌的生长速度而定。
实验结论：
1. 经过培养，观察到细菌在培养基中不断繁殖，并形成全部或部分圆形菌落。
2. 经过染色和显微镜观察，可以进一步分析细菌的形态特征和分类。
实验注意事项：
1. 实验过程中要保持无菌状态，以避免培养基被污染。
2. 移液管、火柴和酒精灯等工具都要用蒸馏水或酒精消毒。
3. 监测培养箱内的温度，以免影响细菌生长。
4. 在培养基中加样品时，要控制好采集样品的量和时间，以免对分析结果产生影响。
通过这次实验，我们了解了细菌的生长特征和分类方法，掌握了常用的培养方法和技巧。
在以后的研究中，这些都将为我们提供必要的帮助。
微生物 医学细菌
细菌S型和R型
（二）细胞膜
细胞膜又称质膜，紧贴细胞壁肽 聚糖的内侧，由磷脂和蛋白质组成。
功 能 ①选择性渗透和转运作用 ②细胞呼吸作用 ③生物合成作用 ④分泌水解酶和致病性蛋白 ⑤形成中介体（mesosome）
中介体（中体/中间体）:
又称为拟线粒体。细菌细胞膜折皱内陷而形成
极体
白喉棒状杆菌经亚甲蓝染色后的形态
（四）核质(nuclear material)
细菌的遗传物质称为核质（区）或拟核，无核 膜、核仁和有丝分裂器。1~2个 化学组成：DNA、RNA、蛋白质 功能：与真核细胞的染色体相似。 结构： 裸露双股DNA分子反复回旋卷曲盘绕组 成松散网状结构。
核质也称细菌染色体
菌毛
鞭毛
基本结构
1.细胞壁 （cell wall）
主要功能：
（1）维持细菌外形; （2）抵抗低渗外环 境；（3）协助鞭毛运动；(4)参与物质交换； (5)决定菌体的免疫原性;(6)与细菌革兰氏染色反 应相关。
细胞壁的化学组成：
G+
G-
革兰阳性菌（G+）：肽聚糖（黏肽）、磷壁酸、特殊蛋白质 革兰阴性菌（G-）： 肽聚糖、外膜层
第二节 细菌的增殖与培养
细菌要进行增殖，产生子代细胞，需要哪些营 养物质呢？
提供代谢介质 直接参与代谢 降低胞内温度 维持大分子构象
水
营养物质
氮源
碳源
生长 因子
合成细胞结构， 提供能量
生长必需 自身不能合成
合成含氮物质 提供能量
无机盐
如维生素、某些氨基酸、 嘌呤、嘧啶等 流感嗜血杆菌 ： X因子 （高铁血红素）、 V因子（辅酶Ⅰ或Ⅱ）
内容
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
纯培养形态观察实验报告
纯培养形态观察实验报告通过观察不同微生物的纯培养形态，了解其形态特征和生长规律，进一步了解微生物的基本特性。
实验步骤：1. 选择待观察的微生物，如细菌或真菌等。
根据实验目的，选择适合的培养基。
2. 准备培养基，如琼脂平板、液体培养基等。
将培养基分装到培养皿或试管中。
3. 进行无菌操作，以避免外界微生物的污染。
使用无菌技术将待观察的微生物接种到培养基中。
4. 将接种好的培养皿或试管密封，放置于恒温箱或培养箱中，以适合微生物生长的温度进行培养。
5. 观察培养基上微生物的生长情况。
可以通过肉眼或放大镜进行观察，也可以使用显微镜进行观察。
6. 打开培养皿或试管，仔细观察微生物的形态特征。
可以观察其颜色、形状、大小等。
7. 记录观察到的微生物形态特征，并与已知的标准形态进行对比。
可以用图像或文字描述形态特征。
8. 观察微生物生长规律，如生长速度、生长方式等。
记录生长的时间和观察到的变化。
9. 实验结束后，进行消毒处理，以防止微生物的传播和污染。
实验结果：在观察微生物纯培养形态时，应注意以下几个方面：1. 形状：观察微生物的外形特征，包括圆形、椭圆形、菌丝状等。
2. 颜色：观察微生物的颜色特征，如无色、白色、黄色、绿色等。
3. 大小：观察微生物的大小特征，可以通过目测或显微镜下测量。
4. 生长方式：观察微生物的生长方式，如点状、斑状、涂片状等。
5. 生长速度：观察微生物的生长速度，可以通过观察生长的时间和观察到的变化来判断。
6. 特殊结构：观察微生物是否有特殊结构，如胞囊、孢子等。
7. 产生的代谢产物：观察微生物是否产生代谢产物，如气泡、颜色变化等。
通过实验观察，我们可以得到以下结论：1. 不同微生物有不同的形态特征，如形状、颜色、大小等，这些特征有助于鉴定微生物种类。
2. 微生物的生长速度和生长方式也各不相同，可以通过观察这些特征来了解微生物的生长规律。
3. 一些微生物具有特殊结构，如孢子和胞囊，这些结构对微生物的繁殖和传播起到重要作用。
临床微生物学检验技术(85页)
应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
4．β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验） 原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。 方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。
3．甲基红（MR）试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。 方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。
二、染色标本
细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因此染色标本的检查在细菌的初步鉴定中应用最广，起着非常重要的作用。 （一）常用染料：酸性染料、碱性染料、复合染料。 （二）常用的染色方法：革兰染色、抗酸染色、 荧光染色。
革兰染色
二、培养接种
（一）划线接种 1.方法 斜线法 、曲线法 、方格法 、放射法 、四格法。
斜线法
微生物学--细菌检验基本技术
• 常用的指示剂：酚红、中性红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、 甲基红等
一、培养基
（二）培养基分类
1．按成分分类
• 合成培养基：是人工合成，组分明确，都是无机盐和化学 纯物质组成的培养基 • 天然培养基：也称复合培养基。是指含有化学成分不完全 明了或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成的培养基， 如蛋白胨、牛肉膏、肉浸液、鸡蛋、马铃薯等。细菌检验常 用
一、培养基
6．灭菌 • 高压蒸汽灭菌
• 无糖：103．4kPa
121．3℃维持
15~20min
• 有糖： 68．95kPa 115℃ 维持
15min
• 间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋 • 血清凝固器灭菌
一、培养基
7．质量检验 • 无菌试验：将制好的培养基在35℃温箱培养过夜，判定是否 灭菌合格 • 效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的 生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基 是否符合要求
（2）结果 抗酸性细菌和非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
三、细菌染色标本的检查
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查
3．其他染色方法
（1）鞭毛染色 （2）荚膜染色
第二节 细菌的培养与分离技术
重点提示
• 培养基的主要成分及作用 • 培养基的种类 • 培养基制备的基本程序 • 细菌接种与培养方法 • 细菌在培养基中的生长现象
2020/2/28
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常用诊断流程
• 表解法 区别比较复杂细菌，将各种细菌及其多 种
特性列成矩阵表格，使相互区别点十分明显，便于分析 比较
•
肠杆菌科初步分属
微生物免疫学实验报告
1实验内容：2显微镜油镜的使用与保护。
3细菌的形态与结构的观察。
4实验目的：5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。
6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。
7熟悉细菌的特殊结构。
8实验材料：显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。
4实验方法：(1)显微镜油镜的使用与保护显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。
因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。
1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。
2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。
对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。
3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。
⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。
⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。
4、显微镜的保护：⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。
⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。
避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。
⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。
置于干燥处，以防受潮。
(二)细菌形态观察1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌2、细菌的特殊结构：荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌鞭毛：水弧菌（周毛菌）一、实验内容：3细菌标本片的制备（操作）4革兰染色法（操作）二、实验目的：1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。
试述细菌性传染病微生物学诊断的基本内容
试述细菌性传染病微生物学诊断的基本内容细菌病实验室诊断的主要内容一、料的采集、保存和运送1、采集遵循的原则：(1)防止污染：剖检场所：应选择便于消毒、不渗水的解剖地点，最好有专门的剖检场所和剖检台。
剖检前，动物尸体应浸泡消毒;做好个人防护：剖检过程中，注意个人防护;做好个人防护：剖检过程中，注意个人防护;焚烧或深埋：剖检后动物尸体和病料焚烧灭菌或消毒深埋。
(2)无菌采样：目的：防止病料被污染;措施：所用器械和器皿必须灭菌，点燃酒精灯，注意无菌操作; (3)适时采样：细菌丰富增殖时期、病料应该新鲜：取濒死动物或刚死亡的动物，死亡动物采集病料夏天不宜迟于 6～8h，冬天不迟于24h：(4)适当部位：根据疾病的类型和表现采集病变最典型的部位2、病料采集方法(不同病料不同方法)(1)实质脏器：剖开体腔后，立即采集，置于无菌容器内;污染或剖开过久的被检器官：先烧烙表面，然后在烧烙的深部取一块实质脏器，放在灭菌容器内。
如有细菌检验条件，可在剖检后直接做病料的触片染色和细菌的分离培养。
(2)液体材料：脓汁、胸水一般用灭菌的棉棒或吸管吸取放入试管内，塞好棉塞送检。
血液可无菌操作从静脉或心脏采血，然后加抗凝剂(每1ml血液加3.8%枸橼酸钠0.1ml)。
若需分离血清，则采血后放在灭菌的容器中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出，置于另一灭菌试管中送检。
(3)其他病料：皮肤要取有病变且带有一部分正常皮肤的部位;被毛或羽毛要取病变明显部位，并带毛根，放平皿; 胎儿可将流产胎儿送往实验室，也可用吸管或注射器吸取胎儿胃内容物放入试管送检; 肠道及内容物只需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌水轻轻冲洗后放在平皿内。
3、病料的保存和送检(1)保存：低温保存， 4-10度;灭菌液体石蜡; 30%甘油缓冲盐水;(2)送检：尽快送检，并做好记录(畜主姓名、动物种类、地址、发病情况、欲检部位及检验项目、采集时间等)二、病料中细菌检查方法(一)形态学检查光学显微镜检查染色标本检查法单染色法(如美蓝染色法、复红染色法等)，复染色法(如革兰氏染色法、抗酸染色法等)，特殊染色法(鞭毛染色法、荚膜染色法、芽孢染色法等)，不染色标本检查法(悬滴法、压滴法)(二)分离培养1、细菌分离培养对细菌病诊断的意义培养基中有无细菌生长推断是否为细菌病，菌落的特征用以判断细菌种类，为进一步的生化鉴定、血清学鉴定及动物试验获得纯培养，药敏试验2、分离培养方法：通常用平板培养基对细菌进行分离培养，根据细菌的培养特性选择适合目标菌生长培养基。