基于AuNPs2FPDDA-GO纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及对SirT1蛋白的检测

Vol.34高等学校化学学报No.72013年7月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1612~1616 doi:10.7503/cjcu20121164基于AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及对SirT1蛋白的检测毕文姬,陆丹琴,符　莹,黄齐林,徐志爱,张　文(华东师范大学化学系,上海200241)摘要　基于AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物制备了一种新型电化学免疫传感器,并将其用于SirT1的检测.首先,在电极表面修饰复合材料AuNPs /PDDA⁃GO,然后将目标蛋白SirT1固定到修饰了AuNPs /PDDA⁃GO 的电极表面,再通过特异性免疫反应结合一抗(Ab 1)和辣根过氧化酶标记的二抗分子(HRP⁃Ab 2),最后用示差脉冲伏安法检测电流信号,实现了对SirT1蛋白水平的测定.在优化的实验条件下,SirT1蛋白的浓度在0.1~100ng /mL 范围内与响应电流呈良好线性关系,检出限为0.029ng /mL.关键词　AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物;SirT1蛋白;电化学免疫传感器中图分类号　O657 文献标志码　A 收稿日期:2012⁃12⁃27.基金项目:国家自然科学基金(批准号:21075041)和高等学校博士学科点专项科研基金(批准号:20110076110003)资助.联系人简介:张　文,男,博士,教授,博士生导师,主要从事生物电化学研究.E⁃mail:wzhang@徐志爱,女,博士,副教授,主要从事生物分析研究.E⁃mail:zaxu@ 衰老是生命过程中的一种普遍现象,表现为机体功能的减退㊁应激反应的衰退并伴随死亡率的增加[1].长期以来,人们在探求细胞衰老本质的过程中提出了诸多的解释,如自由基学说㊁免疫学说㊁DNA 损伤修复学说㊁线粒体损伤学说等[2,3],但对于其确切的机制尚不清楚.近年来,人们发现能量限制(CR)可以在绝大多数生物中起到延长寿命的作用[4],并且这种作用和一类进化上高度保守的蛋白质Sirtuin 蛋白家族有关,而沉默信息调节因子1(SirT1)则属于Sirtuin 家族[5].SirTl 是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)的去乙酰化酶(HDAC)[6],具有组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶活性,可以通过调节组蛋白乙酰化的水平㊁基因沉默㊁DNA 修复等因素参与细胞生存㊁寿命和物质代谢过程[7~10].因此,建立一种快速㊁灵敏且特异性强的检测SirT1蛋白表达水平的方法,可以为一些与年龄有关疾病发病机理的研究和新疗法的建立提供重要实验依据.目前,已经有许多方法用于SirT1蛋白的定量检测,如蛋白质印迹法(Western blot)[11]㊁酶联免疫吸附法(ELISA)[12]和电化学分析法[13]等.在这些方法中,电化学免疫传感器由于具有选择性好㊁灵敏度高以及易于小型化等特点而受到了研究者的青睐[14,15].制备理想的免疫传感器,不仅需要有效地固定蛋白并保持其生物活性,还需要较大的比表面积材料以增大反应的接触面积.因此,寻找比表面积大㊁生物兼容性好的材料作为载体固定蛋白是制备免疫传感器的关键步骤.近年来,石墨烯由于具有较大的比表面积㊁良好的导电性能和力学性能,已被广泛用于传感器的构建等多种技术领域[16,17].氧化石墨烯(GO)是石墨烯的派生物,其结构与石墨烯相似,只是表面连有 CO, OH, COOH 等官能团,因此具有了较好的生物兼容性和亲水性[18].金纳米粒子(AuNPs)具有稳定性强及合成操作简单等特点[19,20].AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物可以提供大的比表面积以及更多的催化活性位点,从而增加目标蛋白的固载量,进而增大催化电流,提高免疫检测的灵敏度.本文制备了AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物,并将其修饰在玻碳电极(GCE)表面,再通过共价键合作用结合目标蛋白SirT1,随后通过特异性免疫反应依次结合一抗(Ab 1)和辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(二抗,HRP⁃Ab 2),通过HRP 催化底物H 2O 2产生的电流信号,实现了对SirT1蛋白浓度的定量检测.结果表明,该方法对SirT1蛋白检测的线性范围是0.1~100ng /mL,检测下限为0.029ng /mL.此方法灵敏度高,操作简便㊁快捷,可广泛应用于其它生物样品的检测.1　实验部分1.1　试剂与仪器SirT1蛋白㊁辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG㊁牛血清白蛋白(BSA)㊁硫堇(Th)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA,质量分数20%)均购于Sigma⁃Aldrich Chemicals(St.Louis,MO,USA).羊多克隆SirT1抗体(Ab 1)购于Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,CA,USA).氧化石墨烯购于南京吉仓纳米科技有限公司.氯金酸㊁柠檬酸钠和H 2O 2(质量分数30%)购于国药集团化学试剂有限公司.其它试剂均购于上海试剂有限公司.实验所用试剂均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水(电阻率为18.2MΩ㊃cm).CHl660D 型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);Cary⁃50型紫外⁃可见分光光度计(美国Varian 公司);JEM⁃2010型透射电子显微镜(TEM,日本光学电子公司).1.2　实验过程1.2.1　AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物的制备　参照文献[21]方法,采用沸腾法用柠檬酸钠还原氯金酸制得纳米金溶胶(AuNPs),粒径为10~20nm.参照文献[22]方法将GO 功能化:取2.0mL 0.5mg /mL 的GO 分散溶液与4mL PDDA(质量分数1%)溶液混合,超声30min 使溶液混合均匀.将溶液在5000r /min 转速下离心,用蒸馏水洗涤数次后分散到2.0mL 水中,制得PDDA⁃GO 溶液.参照文献[23]方法,将5.0mL AuNPs 溶液缓慢滴加至上述PDDA⁃GO 溶液中,超声30min.离心洗涤3次后分散到2.0mL 水中,得到紫红色的AuNPs /PDDA⁃GO 溶液.1.2.2　电化学免疫传感器的制备　免疫电极的制备过程如图1所示.将玻碳电极(准=3mm)用Al 2O 3粉抛光至镜面,然后依次用丙酮㊁乙醇㊁二次蒸馏水超声清洗后备用.将10μL AuNPs /PDDA⁃GO 溶液滴涂到电极上,在室温下晾干.再将5μL 目标蛋白SirT1滴涂到电极上,孵育1h.制备的SirT1/AuNPs /PDDA⁃GO /GCE 电极用1.0%(质量分数)BSA 封闭,30min 后用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol /L,pH =7.4)清洗,除去非特异性吸附位点.将5μL 捕获抗体(Ab 1)滴于电极表面,孵育1h.再将5μL HRP⁃Ab 2滴到电极上,孵育1h.清洗后即制得电化学免疫传感器,置于4℃冰箱中保存待用.Fig.1　Schematic representation of the functioning principle of the electrochemicalimmunosensor for detection of SirT11.2.3　电化学免疫传感器检测SirT1　在CHI660D 型电化学工作站上进行电化学检测.采用三电极体系:以所构建的免疫传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极.以含有5.0mmol /L Fe(CN)3-/4-6的0.1mol /L 磷酸盐缓冲溶液(pH =7.4)为底液,用循环伏安法(CV,电压-0.6~0.2V,扫描速度100mV /s)研究电极的电化学特性;以含有2.0mmol /L H 2O 2㊁1.0mmol /L 硫堇的磷酸盐缓冲溶液(0.1mol /L,pH =7.4)作为测定液,用示差脉冲伏安法(DPV,扫描范围-0.6~0.1V,扫速100mV /s)进行检测,通过检测HRP 催化H 2O 2还原电流的大小测定SirT1的浓度.3161　No.7　毕文姬等:基于AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及 的检测2　结果与讨论2.1　AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物的表征图2为GO,AuNPs 和AuNPs /PDDA⁃GO 的紫外⁃可见吸收光谱图.GO 在231nm 处有吸收峰(谱线Fig.2　UV⁃Vis absorption spectra of GO (a ),AuNPs (b )and AuNPs /PDDA⁃GO (c )a );AuNPs 的紫外吸收峰位于524nm 处(谱线b ),而纳米复合物的吸收峰(529nm 处)发生了轻微的红移(谱线c ).图2结果表明AuNPs 负载到了氧化石墨烯上.图3(A)为GO 的TEM 照片.可以看出,其具有明显的褶皱型结构;图3(B)是AuNPs 的TEM 照片,可见其分散性良好,粒径在10~20nm 左右;图3(C)是将AuNPs 固载到GO 上后的TEM 照片,可见在GO 上有很多AuNPs,AuNPs 的粒径较均匀,分布密集,分散性良好,说明AuNPs 组装到了GO上.TEM 结果进一步证明采用此方法可有效地大量固载AuNPs.Fig.3　TEM images of GO (A ),AuNPs (B )and AuNPs /PDDA⁃GO (C )2.2　免疫传感器修饰过程的电化学表征图4(A)是不同修饰电极在含5.0mmol /L Fe(CN)4-/3-6和0.10mol /L KCl 的PBS 溶液中的交流阻抗谱.与裸电极的阻抗值(曲线a )相比,修饰AuNPs /PDDA⁃GO 后(曲线b )电极的阻抗值变小,表明AuNPs /PDDA⁃GO 利于电子的传输,增大了响应电流.进一步修饰SirT1蛋白后,阻抗值增大(曲线c ),表明自组装层阻碍了电子的传递.当BSA 固定到电极上之后(曲线d ),其阻抗值继续增加.随后修饰一抗和HRP⁃Ab 2后,阻抗值进一步增大,这是由于抗体作为非导电性物质会阻碍电子的传递.图4(B)为上述电极相对应的循环伏安曲线图,其结果与交流阻抗谱一致,表明已成功制备免疫传感器.Fig.4　Electrochemical impedance spectra (A )and cyclic voltammograms (B )of the same electrode in PBScontaining 5.0mmol /L Fe (CN )4-/3-6and 0.10mol /L KCl at different stages a .Bare Au electrode;b .AuNPs /PDDA⁃GO electrode;c .SirT1/AuNPs /PDDA⁃GO electrode;d .BSA /SirT1/AuNPs /PDDA⁃GO electrode;e .Ab 1/BSA /SirT1/AuNPs /PDDA⁃GO electrode;f .HRP⁃Ab 2/Ab 1/BSA /SirT1/AuNPs /PDDA⁃GO electrode.4161高等学校化学学报 Vol.34　2.3　测试条件的优化2.3.1　免疫反应条件的优化　在免疫分析技术中,反应温度和孵育时间是影响免疫反应的重要因素.通过考察在10~50℃范围内反应温度对峰电流的影响,发现催化峰电流随温度的升高而增加,在37℃时达到最大值,当温度高于此温度时,峰电流又下降,因此选择37℃作为免疫反应的温度.在免疫反应温度为37℃的条件下考察了孵育时间对催化峰电流的影响,结果发现,随着孵育时间的延长,峰电流逐渐增大,到60min 时趋于稳定,因此确定60min 为最佳反应时间.2.3.2　H 2O 2和硫堇浓度的优化　实验发现,当H 2O 2的浓度达到2.0mmol /L 后,电流信号达到最大并趋于稳定.所以,实验中H 2O 2的最佳浓度选定为2.0mmol /L.同时,考察了体系中加入不同浓度硫堇对电流的影响.实验结果显示,还原峰电流随硫堇浓度的增加而增大,当硫堇浓度为1.0mmol /L时,电流信号趋于稳定,因此,选择1.0mmol /L 作为硫堇的最佳反应浓度.2.4　不同电化学免疫传感器性能的比较比较了分别采用GO /GCE 和AuNPs /PDDA⁃GO /GCE 为基底制备的电化学免疫传感器用于检测Fig.5　Comparison of DPV curves for the detection of SirT1(100ng /mL )with different biosen⁃sors based on GO /GCE (a )or AuNPs /PDDA⁃GO /GCE (b )substrate ,respectively SirT1蛋白的性能.图5为用DPV 检测SirT1(100ng /mL)的电流响应.从图中可以看出,利用AuNPs /PDDA⁃GO /GCE 为基底的免疫传感器获得了较强的电流信号(曲线b ),这是因为AuNPs /PDDA⁃GO /GCE 具有较大的比表面积和优良的电学性能,既增加了目标蛋白的固载量,又提高了电子的转移速率.2.5　电化学免疫传感器检测SirT1在以上优化的实验条件下,将免疫传感器在含有不同浓度SirT1的溶液中孵育60min,随后在7.0mL PBS (0.1mol /L,pH =7.4)中测定不同浓度SirT1的DPV 响应电流,发现电流响应随SirT1浓度的增加而不断增大,SirT1浓度在0.1~100ng /mL 范围内与电流响应呈良好的线性关系,线性回归方程为y =0.0192x +2.7296,相关系数为0.994,检测下限为0.029ng /mL.实验结果表明,该电化学免疫传感器灵敏度高,响应速度快,具有良好的电化学性能,可将其用于SirT1蛋白的定量检测.3　结 论合成了AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物,构建了高灵敏度的电化学免疫传感器,并实现了对SirT1蛋白的电化学免疫检测.该传感器具有制作简单㊁测定线性范围较宽㊁灵敏度高的特点,可以为其它蛋白质的检测提供新的方法和思路.参　考　文　献[1]　Cantuti⁃Castelvetri I.,Shukitt⁃Hale B.,Joseph J.A.,Int.J.Dev.Neurosci .,2000,18(4/5),367 381[2]　Guarente L.,Cell ,2008,132(2),171 176[3]　Gorbunova V.,Seluanov M.Z.,Hine C.,Nucleic Acids Res .,2007,35(22),7466 7474[4]　Wood J.G.,Rogina B.,Lavu S.,Howitz K.,Helfand S.L.,Tatar M.,Sinclair D.,Nature ,2004,430(7000),686 689[5]　Hiroyasu Y.,Kristina S.,Johan A.,Mol.Endocrinol .,2007,21(8),1745 1755[6]　Blander G.,Guarente L.,Annu.Rev.Biochem .,2004,73(2),417 435[7]　Kaeberlein M.,McVey M.,Guarente L.,Genes Dev.,1999,13(19),2570 2580[8]　Tissenbaum H.A.,Guarente L.,Nature ,2001,410(6825),227 230[9]　Longo V.D.,Kennedy B.K.,Cell ,2006,126,257 268[10]　Han S.H.,J.Clin.Neurol .,2009,5,120 125[11]　Xia F.N.,Farmer D.B.,Lin Y.M.,Avouris P.,Nano Lett .,2010,10,715 718[12]　Chu F.,Chou P.M.,Zheng X.,Mirkin B.L.,Rebbaa A.,Cancer Res .,2005,65,10183 101875161　No.7　毕文姬等:基于AuNPs /PDDA⁃GO 纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及 的检测6161高等学校化学学报 Vol.34　[13]　Fan Y.,Martina H.,Ronny L.,Christin W.,Gerhard K.E.,J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54(4),772 778[14]　Gey C.,Kyrylenko S.,Hennig L.,Nguyen L.H.D.,Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,5219 5222[15]　Du D.,Chen W.,Zhang W.,Liu D.,Li H.,Lin Y.,Biosens.Bioelectron.,2010,25,1370 1375[16]　Li D.,Müller M.B.,Gilje S.,Kaner R.B.,Wallace G.G.,Nat.Nanotechnol.,2008,3,101 105[17]　He W.,Zou L.L.,Zhou Y.,Lu X.J.,Li Y.,Zhang X.G.,Yang H.,Chem.J.Chinese Universities,2012,33(1),133 138(何卫,邹亮亮,周毅,卢向军,李媛,张校刚,杨辉.高等学校化学学报,2012,33(1),133 138)[18]　McAllister M.J.,Li J.L.,Adamson D.H.,Schniepp H.C.,Abdala A.A.,Liu J.,Herrera⁃Alonso M.,Milius D.L.,Car R.,Prud’homme R.K.,Aksay I.A.,Chem Mater.,2007,19,4396 4404[19]　Geissler K.,Manafi M.,Amoros I.,Alonso J.L.,J.Appl.Microbiol.,2000,89(2),280 285[20]　Zhang Y.M.,Liu H.Y.,Song W.B.,Chem.J.Chinese Universities,2010,31(1),157 161(张玉敏,刘海燕,宋文波.高等学校化学学报,2010,31(1),157 161)[21]　Enustun B.V.,Turkevich J.,J.Am.Chem.Soc.,1963,85,3317 3328[22]　Cui R.J.,Huang H.P.,Yin Z.Z.,Gao D.,Zhu J.J.,Biosens.Bioelectron.,2008,23,1666 1673[23]　Liu K.P.,Zhang J.J.,Wang C.M.,Zhu J.J.,Biosens.Bioelectron.,2011,26,3627 3632Electrochemical Immunosensor Based on AuNPs/PDDA⁃GOfor Detection of SirT1BI Wen⁃Ji,LU Dan⁃Qin,FU Ying,HUANG Qi⁃Lin,XU Zhi⁃Ai*,ZHANG Wen*(Department of Chemistry,East China Normal University,Shanghai200241,China)Abstract　AuNPs/PDDA⁃GO nanocomposite was produced by combining poly(diallyldimethylammonium chloride)(PDDA)functionalized graphene oxide nanosheets(PDDA⁃GO)and gold nanoparticles(AuNPs) through self⁃assembly method,which offered an efficient platform for antibody immobilization with good bio⁃compatibility.A new type of electrochemical immunosensor based on AuNPs/PDDA⁃GO nanocomposite for the detection of SirT1was then developed.The immunosensor construction consisted of the immobilization of the hybrid architecture,the immunoreaction of target antigen SirT1and capture antibody(Ab1),followed by the binding of HRP⁃Ab2.The designed immunoassay showed an excellent analytical performance,and exhibited a wide dynamic response range for SirT1from0.1ng/mL to100ng/mL with a detection limit of0.029ng/mL. Overall,this developed strategy is proved as a simple,cost⁃effective method,and can be easily extended to other protein analysis.Keywords　AuNPs/PDDA⁃GO nanocomposite;SirT1;Electrochemical immunosensor(Ed.:S,Z,M)。