高雄激素对性成熟前小鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响_江帆
高雄激素血症与多囊卵巢综合征
高雄激素血症与多囊卵巢综合征井冈山大学医学院胡晓玲School of Medicine，Jinggangshan University，Ji'an，Jiangxi 343000，ChinaHU Xiaoling【摘要】多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOs）是育龄妇女常见的生殖内分泌及代谢异常的疾病，至今其病因和发病机制不十分清楚。
但雄激素升高与卵巢多囊性变、月经失调、稀发排卵、多毛、黑棘皮症、痤疮、肥胖、胰岛素抵抗、慢性炎症等的PCOs临床表现密切相关，且与其发生发展互为因果。
因此认为高雄激素血症（Hyperandrogenemia，HA）是PCOs发病机制中的关键因素。
【关键词】高雄激素血症；多囊性卵巢综合征；胰岛素抵抗Hyperandrogenemia and Polycystic Ovary Syndrome 【Abstract】Polycystic ovary syndrome (PCOs) is a common reproductive endocrine and metabolic disorder disease for women of child-bearing age. Its cause and mechanism is yet unknown. However we found that the high level of androgen is positive correlated to the incident and clinical features of PCOs: ovaries multicystic, menstrual disorder, oligotrichia ovulating, hirsutism, acne, acanthosis nigricans, obesity, insulin resistance, chronic inflammation. And causal relationship is detected. Therefore we presume hyperandrogenemia (HA) is one key factor leading to the outbreak of PCOs.【Key words】Hyperandrogenemia（HA）；Polycystic ovary syndrome(PCOs)；insulin resistance(IR)【中图分类号】R711.6多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome PCOs）是青春期和育龄妇女常见的生殖内分泌和代谢性疾病。
PGC-1α与卵巢功能及相关研究进展
DOI:10.12280/gjszjk.20200254葛婷，杨晓葵△【摘要】过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator1alpha，PGC-1α）属于人体内一种重要的核转录辅助激活因子，是线粒体生成的关键调节因子，通过与核受体及转录因子的相互作用参与线粒体的生物合成、适应性产热、能量代谢、细胞凋亡、细胞信号转导和肿瘤发生等多种生物学过程。
近年来PGC-1α在卵巢中的作用备受关注，越来越多的研究表明PGC-1α可通过参与卵泡发育、卵泡闭锁、调控卵巢激素合成与分泌等多种途径影响卵巢功能。
PGC-1α的表达和功能异常与卵巢功能减退、多囊卵巢综合征和卵巢癌等病理反应相关。
随着研究不断地深入，PGC-1α通过调控细胞信号转导对卵巢功能的调控机制逐渐被揭示。
本文就PGC-1α在卵巢中的作用及相关研究进展进行综述，为卵巢功能异常及相关疾病的临床诊治提供参考。
【关键词】过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α；卵巢；卵泡；卵泡闭锁；信号传导；多囊卵巢综合征；卵巢肿瘤Research Progress on PGC-1αin Ovary GE Ting,YANG Xiao-kui.Department of Reproductive Medicine,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing100026,ChinaCorresponding author:YANG Xiao-kui,E-mail:***********************【Abstract】Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha(PGC-1α),an importantnuclear transcription coactivator,is a key regulator of mitochondrial production.PGC-1αis involved in variousbiological processes such as mitochondrial biosynthesis,adaptive thermogenesis,energy metabolism,apoptosisinduction,cellular signal transduction and tumorigenesis through interaction with nuclear receptors andtranscription factors.In recent years,many studies have shown that PGC-1αparticipats in the folliculardevelopment and atresia,and ovarian hormones synthesis and secretion.The abnormal expression of PGC-1αcanresult in reproductive and endocrine problems and disorder,such as diminished ovarian reserve,polycystic ovarysyndrome and ovarian neoplasms.With the continuous in-depth study,the mechanism of PGC-1αin theregulation of ovarian function will be discovered.This review briefly summarized the function of PGC-1αin ovaryand research progress,which may provide new reference for the diagnosis and treatment of some ovarian diseases.【Keywords】Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha;Ovary;Ovarian follicle;Follicularatresia;Signal transduction;Polycystic ovary syndrome;Ovarian neoplasms（ＪＩｎｔＲｅｐｒｏｄＨｅａｌｔｈ蛐ＦａｍＰｌａｎ，2021，40：142-146）·综述·基金项目：国家自然科学基金（81871133）；北京市医院管理局2018年度“扬帆”计划重点医学专业（ZYLX201830）；北京市医院管理中心“登峰”人才培养计划（DFL20191401）作者单位：100026北京，首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科通信作者：杨晓葵，E-mail：***********************△审校者卵巢是女性的重要性腺，其主要功能为产生卵母细胞和分泌性激素。
不同剂量激素处理对小鼠超数排卵及产仔性能的影响
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ， ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２ — ２ ０ ９ ０ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ３ ． ０ ０ ８
不 同剂 量激 素 处 理对 小 鼠超 数排 卵及产 仔 性 能 的影 响
周 晓旭 。 李雁 冰 ， 宁博 林 。 孙 蕊 。 郭丽 ， 李庆 达 ， 韩静 。 ， 李 井春
２ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｂ ａ ｙ ｉ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｓ ｒ ｉ ｔ ｙ ；
３ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｙ， ｇ Ｈｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｂ ａ ｙ ｉ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｓｉ ｒ ｔ ｙ ）
第２ ７卷 第 ３ 期
２ ０１ ５焦
６月
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 ｙ ｉ Ａｇ ｉ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｂａ
２ ７ （ ３ ） ： ３ ２ ～ ３ ５
中图 分 类 号 ： ￥ ８ １ ４ ． ８ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ： １ ０ ０ ２ — ２ ０ ９ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ — ０ ０ ３ ２ —Ｄｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎ ｔ Ｄｏ ｓ ｅ Ｈｏ ｒ ｍｏ ｎ ｅ ｏ ｎ Ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ — Ｏ Ｖ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ
高雄激素诱导多囊卵巢综合征表观遗传机制的研究进展
1.1 基于组蛋白修饰 组蛋白是一种八聚体结构，有组蛋白H2A 、H2B 、H3和H4各两个副本组成，由DNA 和连接蛋白H1包裹。
组蛋白尾部的化学修饰（如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和类泛素化）通过影响转录因子的结合从而影响基因转录和细胞表型（图1）。
Guo 等［9］和Sinha 等［10］以绵羊为实验模型，于妊娠期30~90 d 腹腔注射TP ，结果显示卵巢颗粒细胞中产前雄激素干预影响了DNA 甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1， DNMT1）和DNMT3B 的基因修饰，使得组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（tri‐methylation of lysine 9 in histone H3， H3K9me3）水平升高，并显著影响了卵巢中膜细胞的组蛋白甲基化［9］；对母羊和幼羊实施卵巢摘取并进行RNA 测序，显示母羊与幼羊之间的基因差异性表达并不一致，进一步开展母羊组蛋白研究，显示产前处理分离的卵巢中H3K9me3、组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（acetylation of lysine 27 in histone H3， H3K27ac ）和组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化（acetylation of lysine 9in histone H3， H3K9ac ）水平显著升高，但是组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 4 in histone H3， H3K4me3）水平并无显著变化［10］。
由此推测，产前雄激素的暴露会引起跨代表观遗传改变，这为PCOS 的发生发展提供了一个研究方向。
产后雄激素诱导研究显示，雄激素可作用于基因的启动子以及增强子区域，通过减少组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 27 in histone H3， H3K27me3），上调H3K27ac ，调控下游多种基因的表达，促进PCOS 的发生发展［11］。
雄激素及其受体在卵巢中的作用
雄激素及其受体在卵巢中的作用王芳芳;潘洁雪;任珺n;黄荷凤【摘要】雄激素是卵巢基本功能的重要维持者,通过与雄激素受体结合激活下游的信号通路,从而发挥其生理功能.虽然雄激素及其受体在卵巢卵泡发生过程中发挥的重要作用已被广泛公认,但迄今为止,卵巢中详细的雄激素下游通路尚未明确.对基因敲除小鼠的研究使研究者们对雄激素受体在卵巢卵泡发生过程中作用的理解更加深入.就雄激素及其受体相关分子通路在卵巢中的作用及意义进行了综述.【期刊名称】《国际妇产科学杂志》【年(卷),期】2014(041)001【总页数】4页(P14-17)【关键词】雄激素;受体;信号传导;卵巢;卵泡【作者】王芳芳;潘洁雪;任珺n;黄荷凤【作者单位】310006,杭州,浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科;310006,杭州,浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科;浙江大学医学院教育部生殖遗传重点实验室;上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院【正文语种】中文人体内存在多种形式的雄激素，其中，内源性雄激素中最主要的成分睾酮可被5α-还原酶转化为更有效力的5α-双氢睾酮（dihydrotest osterone，DHT），这2种雄激素最终都将会结合并激活雄激素受体（androgen receptor，AR）[1]。
因此，AR 成为雄激素介导信号通路的重要因子。
AR是甾体核受体超家族的成员之一，除此之外，该家族还包括肾上腺皮质激素受体、雌激素受体、孕激素受体、甲状腺素受体、维甲酸受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、维生素D受体等。
与睾酮、DHT结合后，AR通过继发的构象变化而影响其与蛋白、DNA的相互作用及核转运过程。
AR参与了全身多种器官的功能调节，介导了细胞增殖、分化、凋亡、代谢、分泌等多重要环节，是维持组织稳态的关键因子。
同时，雄激素也在多种疾病的发病过程中发挥重要作用，如多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢早衰、性腺功能减退、良性前列腺增生、前列腺癌等[2]。
抗高雄治疗对PCOS生殖的影响 ppt课件
诊断标准
患有PCOS的女性中 • • • • 72% 有多毛症 14.5% 有痤疮 60% 为过度肥胖 33% 不能生育 100% 不能排卵
疑似PCOS
• 月经稀发或闭经或不规则子宫出血 • 高雄激素症状或超声表现为PCOS
确诊PCOS
• 排除其他可引起高雄激素疾病和引起 排卵异常疾病
不良妊娠
高雄影响PCOS患者卵母细胞成熟及胚胎发育
影响卵母细胞成熟及胚胎发育的卵巢因素及非卵巢因素
非卵巢因素
黄体生成素 卵泡刺激素 胰岛素 雄激素
表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 胰岛素样生长因子 神经生长因子 转化生长因子β 血管内皮生长因子 细胞因子
卵巢因素
改变
卵母细胞异常
胚胎异常
12 1.Jie Qiao, et al. Extra- and intra-ovarian factors in polycystic ovary syndrome: impact on oocyte maturation and embryo developmental competence. 2.Human Reproduction Update.2011;17(1):17-33.
7
多毛、痤疮
高雄可导致多毛、痤疮
• •
高雄激素血症：60-80%的患者存在游离睾酮的升高1
高雄激素体征：
60%患者出现多毛症1 15%-25%患者出现痤疮1 脂溢性皮炎、毛孔增粗和颞部脱发是青春期PCOS高雄激素的临床表现2
•卵巢雄激素合成亢进，直接作用与卵巢，雄激素及其相应底物浓度升
高，是临床表现为多毛、痤疮男性型脱发的生化基础3
不良妊娠
高雄影响PCOS患者卵母细胞成熟及胚胎发育
MG132对小鼠卵母细胞排卵后老化的调控作用
扫描共 聚焦显微镜观察并照相 。用二极 激光管 的 ４ ０ ５ ｎ ｍ 波
长激发 Ｈ ｏ ｅ ｅ ｈ ｓ ｔ ３ ３ ３ ４ ２荧光 ； 用氩激光管 的４ ８ ８ ｎ ｍ和氦／ 氖激 光管的 ５ ４ ３ ｎ ｍ波长分别激发 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ和 ｃ ｙ ３荧光。
１ ． １ １ 数 据 统 计 分 析
停滞在 ＭⅡ期 的哺乳动 物卵母 细胞若 不及 时受 精或 激 活， 就会发生老化… 。老化 卵母 细胞表 现为孤 雌激活率 和碎 裂率都增 高、 促成熟因子（ ｍ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｉ ｎ ｇ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ， Ｍ Ｐ Ｆ ） 和
促分裂原 活化蛋 白激 酶 （ ｍ ｉ ｔ ｏ ｇ ｅ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ， Ｍ Ａ Ｐ Ｋ）
取 注射 Ｈ Ｃ Ｇ １ ３ ｈ后 的 卵母 细 胞 置 于 添加 不 同浓 度
ＭＧ １ ３ ２的 Ｈ Ｃ Ｚ Ｂ培养孔 中， 于３ ７ 、 ２ ５ 、 １ ５℃下 处理 不 同时间 后， 用 乙醇联合 ６一Ｄ ＭＡ Ｐ激活方法激活 。从 表 １可见 ， 同一
温度下 ， 卵母细胞的孤雌 激活敏感性 随着培养时 间的延长而
在一定时间 内有效抑 制卵母 细胞老化 的方案 。本研究不仅有 利于理解卵母 细胞老化和调控 的机制 ， 而且有利 于辅助生殖 技术与胚胎工程技术 的发展 。
影响小鼠发育过程中的几个重要因素
影响小鼠发育过程中的几个重要因素王晓会124120035（云南师范大学生命科学学院，云南昆明650500）摘要：在一个生物体发育过程中，影响其正常发育的因素有很多，本文通过阅读并分析近年国内公开发表的与小鼠发育相关的文章，根据有关文献, 综合分析、归纳总结了小鼠睾丸发育全过程，小鼠睾丸TERT与小鼠发育的关系，小鼠硫酸乙酰肝素对小鼠发育的影响，神经前体细胞( neural progenitor cell，NPC)与小鼠发育的联系，miRNA 在小鼠发育过程中的作用，以及高尔基体与小鼠发育的联系和核糖核酸和与NADP对小鼠发育的影响等。
关键词：小鼠发育；小鼠硫酸乙酰肝素；小鼠睾丸TERT；神经前体细胞；miRNA；高尔基体；核糖核酸和与NADPImportant factors in the process of development in miceWangXiaohui 124120035(The Life of Science ,YunNan Normal University,KunMing650500,china)Abstract:There are many factors that can influence the development of a living organism. In this article, through reading and analysis domestic published articles that related to development in mice recent years, to conclude some factors that can influence the development of mice.Including Mice testis development process; Testis TERT relationship in the development of mice;The influence in the development of heparan sulphate in mice;The function of miRNA; Influence of Golgi Apparatus during Mouse Oocyte Development invitro ; The influence of ribonucleic acid and the NADP.Key Words:Mouse Development; Heparan sulfate; Testis TERT; mi RNA; Golgi Apparatus;Ribonucleic acid and the NADP1小鼠睾丸发育全过程[1]睾丸是重要的雄性生殖腺，可产生精子和雄性激素，对雄性生殖系统的发育起着重要作用。
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·论著·高雄激素对性成熟前小鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响江帆李梅赵考考刁飞扬马翔崔毓桂刘嘉茵DOI ：10.3877/cma．j．issn．1674-0785．2012．05．023基金项目：国家自然科学基金（81070465）；973项目（2012CB944902）作者单位：210029南京医科大学第一附属医院生殖医学科通讯作者：刘嘉茵，Email ：jyliu_nj@126．com 【摘要】目的观察高浓度雄激素对性成熟前小鼠卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响，初步探讨其机制，为研究多囊卵巢综合征（PCOS ）病理生理机制积累更多的实验资料。
方法体外培养21d 龄小鼠卵巢颗粒细胞，用不同浓度的睾酮（10－5，10－6，10－8mol /L ）作用24、48、72h ，噻唑蓝（MTT ）比色法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，Realtime PCR 检测Caspase-3/9、Bcl-2、Bax 等凋亡因子的变化。
结果10－5mol /L 睾酮显著增加颗粒细胞的细胞活力；10－5mol /L 睾酮作用48h ，细胞周期由G1期进入S期，细胞早期凋亡率减少1.36%，Caspase-3活性降低，Caspase-3/9、Bcl-2、Bax mRNA 水平表达均下降。
结论高浓度雄激素增加性成熟前的卵巢颗粒细胞的细胞活力，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，其作用可能通过抑制线粒体通路相关的凋亡因子的表达。
本研究提示，性成熟前的高雄激素作用，可能是导致青春期PCOS 发生的原因之一。
【关键词】多囊卵巢综合征；粒层细胞；细胞增殖；细胞凋亡；雄激素增多症Effect of hyperandrogen on the proliferation and apoptosis of ovarian granulosa cells of pre-adolescent mouseJIANG Fan ，LI Mei ，ZHAO Kao-kao ，DIAO Fei-yang ，MA Xiang ，CUI Yu-gui ，LIU Jia-yin．State KeyLaboratory of Reproductive Medicine ，Clinical Center of Reproductive Medicine ，First Affiliated Hospital ，Nanjing Medical University ，Nanjing 210029，ChinaCorresponding author ：LIU Jia-yin ，Email ：jyliu_nj@126．com 【Abstract 】ObjectiveTo observe the effect of testosterone on the proliferation and apoptosis of ovariangranulose cells （GCs ）of pre-adolescent mouse ，so as to investigate the pathophysiological mechanism of adolescent polycystic ovary syndrome （PCOS ）．MethodsGCs from mouse pre-adolescent ovary were differently treated withtestosterone at higher concentration of 10－5，10－6，10－8mol /L for 24，48，72h．Cell viability and growth rate of GCs were assayed by MTT methods．After exposure to testosterone （10－5mol /L ）for 48h ，cell cycle and apoptosis rate of GCs were detected by flow cytometry．Caspase-3activity was detected by absorption spectrometry．Expressions of Caspase-3/9，Bcl-2and Bax mRNAs in the treated GCs were determined by real-time RT-RCR．Results Cellviability of pre-adolescent mouse GCs was significantly increased in the group treated with testosterone at 10－5mol /L （P ＜0.05）．When compared with the control group ，the cell cycle from G1phase into S phase in the testosterone exposure group significantly changed ，while the early apoptosis rate significantly decreased by 1.36%（P ＜0.05）．Caspase-3activity significantly decreased in the testosterone treated group ，and the expression levels of Caspase-3/9，Bcl-2and Bax mRNAs significantly decreased （P ＜0.05）．ConclusionsAndrogen at higher level can promote cellviability and inhibit the early apoptosis of GCs by inhibiting the mitochondrial pathway of apoptosis-related factor expression．This study suggests that hyperandrogenism in pre-adolescent ovary may be part of pathophysiological mechanism of adolescent PCOS．【Key words 】Polycystic ovary syndrome ；Granulosa cells ；Cell proliferation ；Apoptosis ；Hyperandro-genism多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome ，PCOS ）是青春期及育龄妇女常见的异质性内分泌疾病，以高雄激素血症及慢性无排卵为临床特征。
PCOS 卵巢所含窦状卵泡是正常卵巢的2 3倍，卵泡发育到4 7mm 时便停止发育［1］。
青春期PCOS 的发病，过多的雄激素是一个关键的因素，而高雄激素又是卵巢内小卵泡过多的原因之一［2］。
雄激素受体在卵泡发育的早期即有表达，并在窦前卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞上表达最为显著。
研究证实［3-5］，高雄激素作用可以增加恒河猴和啮齿类动物卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡的数量。
在卵泡的生长发育过程中，作为卵泡体细胞的颗粒细胞，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞的发育、成熟及其功能起重要的调控作用，进而影响卵泡的启动、发育、成熟及闭锁的全过程［6-7］。
因此，颗粒细胞的分化、生长和凋亡在原始卵泡启动及之后的卵泡发育与闭锁中都起重要作用。
本文旨在观察高雄激素调控性成熟前小鼠的卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，探讨其分子信号机制，进而讨论对卵泡发育与闭锁的影响，为进一步探索青春期PCOS的病理生理机制积累更多的资料。
材料和方法一、主要试剂与仪器睾酮、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品，DMEM/F12培养液为Hyclone公司产品，胎牛血清（FBS）为杭州四季青生物公司产品，透明质酸酶为美国罗氏公司产品，胰酶细胞消化液为碧云天生物技术研究所产品，Caspase-3活化度由凯基公司用分光光度法检测试剂盒检测，Bcl-2、Bax、Caspase-3/9引物合成于上海英骏生物技术有限公司，RNA抽提试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、DNA marker DL2000为日本TakaRa公司产品；酶标仪Model680为美国BIORAD公司产品，FACSCalibur 流式细胞仪为美国BD公司产品，Prism7300型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
二、细胞来源及培养选择21d龄雌性ICR小鼠，购置于南京医科大学实验动物中心。
脱颈椎法处死小鼠，无菌条件下取出卵巢置于PBS中，清洗三遍，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液置于37ħ，5%CO2细胞培养箱中孵育15min，用细针反复刺破卵巢内卵泡，使颗粒细胞释放入DMEM培养液中，加入0.1%透明质酸酶消化分离细胞2min后，用200目筛网过滤培养液后离心收集细胞，用PBS洗涤1次后加入10%FBS的DMEM/ F12培养液（含100U/ml青霉素、链霉素）重悬细胞，将细胞均匀接种到60mm培养皿中，置入37ħ、5%CO2培养箱中培养，24h后细胞可贴壁生长。
三、MTT检测不同浓度睾酮对青春期前小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响取对数生长期的颗粒细胞，调整细胞浓度至1ˑ108cell/L接种于96孔板，每孔200μl，每组6个副孔，分别予不同浓度睾酮10－8、10－6、10－5mol/L处理24h，48h，72h。
每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37ħ继续孵育4h弃上清，每孔加入DMSO150μl，振荡10min，使结晶物完全溶解。
设置空白对照（与实验孔平行，不加细胞只加培养液）。
选择490nm波长，酶标仪检测各孔吸光度（A）值。
计算细胞生长增殖率。
细胞生长增殖率（%）=实验组A值平均值/对照组A值平均值ˑ100%。
四、流式细胞术分析颗粒细胞细胞周期和细胞凋亡1．流式细胞术分析雄激素作用下颗粒细胞细胞周期：取对数生长期细胞，对照组不予处理；实验组用睾酮（10－5mol/L）作用颗粒细胞48h后，胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞沉淀，用2ml75%冷乙醇悬浮细胞并固定，冻存于－20ħ冰箱中，检测前将细胞密度调整为106个/ml，加入0.5ml PBS，20μl（500μg/ml）碘化丙啶和10μl RNA酶（10mg/ml），于室温下，暗处放置30min后，用流式细胞仪检测。