EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

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HPV18E5与EGFP融合基因真核载体的构建及表达

ｈ
转化大肠埃希菌ＤＨ５一Ｏｔ，蓝白斑筛选。测序正确的质粒和真核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ分别进行Ｋｐｎ
ＥｃｏＲＩ、
后提取细胞中的总ＲＮＡ，反转录成ｅＤＮＡ，ＲＴ—ＰＣＲ电泳扩增出一条大小为２２２ｂｐ条带，与ＨＰＶｌ８Ｅ５基因条带相符，内参Ｂ—ａｃｔｉｎ约为３９９ｂｐ（图２）。２．４荧光显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达重组质粒转染ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞４８ｈ后，在荧光显微镜下可观察到清晰的荧光存在。由于ＥＧＦＰ位于Ｅ５基因下游，启动子在Ｅ５基因上游，说明构建
ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ
Ｉ酶切鉴定（图１），分别得到与
ｍｉｎ、变性９４℃３０Ｓ、退火５５℃３０Ｓ、延伸７２℃
１０
ＨＰＶｌ８Ｅ５（２２２ｂｐ）、ＥＧＦＰ（７２０ｂｐ）、ＨＰＶｌ８Ｅ５－ＥＧＦＰ融合基因（９４２ｂｐ）大小相同的片段。重组质粒序列经测定并比对，结果正确。
２．３
Ｓ，３０个循环后７２。Ｃ
Ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
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２ｂＤ３
４
抑制细胞凋亡。研究表明，中国宫颈癌和食管癌患者中ＨＰＶｌ８型的比例仅次于ＨＰＶｌ６型，而对ＨＰＶｌ８型的研究也主要集中在Ｅ６、Ｅ７基因上，对于ＨＰＶｌ８Ｅ５的研
２０００７５０２５０
ＨＰＶｌ８Ｅ５．ＥＧＦＰＥＧＦＰ

登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体的构建及免疫效果研究

ｐｏｅｎｗｓｉｅｔｅｙｉｄｒｃｍｎｆｏｅｃｎｓａｎｓｒｌｔＴｅｔｒｖｅｔｒｃｍｉａｔｐａｍｉｓｗｒｓｄｔｅｉｒｔｉａｎｉｄｂｉｔｍｕｏｕｒｓｅｔａｓｙａｄＷｅｔｎｂｏ．ｈｅａａｎｅｏｎｎｌｓｄｅｅｕｅｔｍｍｕｉｄｆｉｎｅｉｌｅｔｌｂｏｈｎｚｅｍｉｅｔｏｓｌｅｔｅｒｉｃｏｈｅｖｈｉｍｍｕｏｅｉｉｄａｉｔｏｉｄｃｅｔｌｉｇａｔｏｉｓＲｅｕｔ：ｈｅｕｓｓｏｅａｅｒｃｍｉａｔｐｏｅｎ＇ｎｇｎｃｔａｂｌｙｔｎｕｅｎｕｒｉｎｉｄｅ．ｓｌＴｅｒｓｈｈｗｄｔｔｔｅｏｎｎｒｔｉｙｎｉａｚｎｂｓｈｈｂｃｕｄｂｘｒｓｅｙＢ－１ｃｌ．ｃｍｍｕｉｄｗｔｅｒｖｅｔｐａｍｉｓｗｒｂｅｔｒｄｃｅｔｈｉｇａｔｏｉｓａａｎｔｄｎｕｏｌｅｅｐｅｓｄｂＨＫ２ｅｌＭｉｉｓｅｎｚｉｔｔａｎｌｓｄｅｅａｌｏｐｏｕｅｎｕｒｚｎｎｉｄｅｇｉｓｅｇｅｅｈａｌａｂ
ｋｒｔｅｔＣＮ３１＋）ｅｅｔｒｏｂｎｎｉｅｔｌｍｄ，ｅａｓｃｔＢＫ２ｅｓＥｐｅｓｎｏｅｒｃｍｉｎａｏｃｖｃｒＤＡ．（ｔｇｎｒｅｅｍｉｔｖｎｐａｉｔｎｔｎｆｔｉｏＨ－１ｃｌ．ｘｒｉｆｏｎｔｙｉｏｐｏａｃａｂａｓｓｈｌｒｅｅｎｄｌｓｏｈｔｅｂａ

蛋白质egfp融合蛋白

蛋白质egfp融合蛋白蛋白质EGFP融合蛋白（EGFP-fusion protein）是由一种绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）与其他蛋白质序列融合而成的蛋白质复合体。

EGFP是一种由Aequorea victoria水母产生的蛋白质，具有独特的荧光特性，能够在外源激发光源的作用下自发发出绿色荧光。

EGFP-fusion protein在生命科学研究中被广泛应用，可以通过显微镜观察该融合蛋白的在细胞和组织中的分布和定位，从而研究该蛋白质的生物学功能和调控机制。

本文将介绍EGFP-fusion protein的构建步骤、应用领域以及存在的挑战和未来发展方向。

首先，构建EGFP-fusion protein需要克隆目标蛋白质的编码区域，通常使用基因克隆技术将EGFP序列与目标蛋白质的编码序列进行连接。

常用的方法是PCR扩增目标蛋白质的编码序列，并在其N或C端引入适当的限制酶切位点，然后将PCR产物与EGFP载体进行双酶切和连接。

连接产物可经过测序验证，进一步进行细胞转染或转基因模型构建等应用。

在应用方面，EGFP-fusion protein可以用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布，例如可以用EGFP-actin融合蛋白来研究细胞骨架的重组和功能。

此外，EGFP-fusion protein还可以用于蛋白质相互作用的研究，通过融合EGFP和其他蛋白质的序列，可以观察到这些蛋白质在细胞内的共定位情况，从而推测它们之间可能发生的相互作用。

然而，构建并应用EGFP-fusion protein也面临一些挑战。

首先，蛋白质的融合可能对其原有的结构和功能产生影响，因此需要对融合蛋白进行验证，确保其具备正常的生物学活性。

其次，EGFP的荧光特性可能会受到融合蛋白的结构和环境的影响，从而导致荧光信号强度和彩色性能的改变。

最后，EGFP的表达可能会受到细胞毒性和光毒性的影响，因此需要合理选择表达系统和实验条件，以确保实验的准确性和稳定性。

融合蛋白d-EGF的结构预测、克隆、原核表达及鉴定

中文摘要目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。

方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。

在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。

采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG 诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。

最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。

结果：采用DNAStar 软件的Gamier Robson 方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。

融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。

成功构建β-defensin-3、EGF 重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。

转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS-PAGE 分析得到28 kD左右的目的蛋白条带。

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

中国组织工程研究与临床康复第 15 卷第 31 期 2011–07–30 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 30, 2011 Vol.15, No.31
真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定*☆
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
5839

邱明链，等. 真核表达载体 pIRES2-EGFP-hFasL 的构建及鉴定
福建医科大学附属第一医院，1 胸外科，4 肝病中心，福建省福州市 350005；2 西安医学院附属医院病理科，陕西省西安市 710077；3 福建医科大学基础医学院病理系，福建省福州市 350004
上海艾普拓普生物科技有限公司
大连 Takara 公司
QIAGEN 公司上海艾普拓普生物科技
有限公司大连 Takara 公司 Pharmacia Biotech 公司 Thermo
实验方法：外周血单核细胞的制备：取正常人新鲜抗凝血 5 mL与Hanks液等量混匀后，加于4 mL淋巴细胞分离液上，离心收集细胞，用5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640CM培养液悬浮，加入25 mg/L的ConA，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育24 h。 RT-PCR 扩增 hFasL 基因：ConA刺激后的淋巴细胞，经 Trizol 试剂盒据说明书提取总 RNA。反转录体系：模板RNA溶液5 µL，5×RT buffer 4 µL，dNTP(各10mmol/L)混合物2 µL， RNA酶抑制剂0.5 µL，引物设计参照GenBenk 上hFasL序列分别设计上、下游引物。上游引物： 5’ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT C 3’；下游引物：5’TTA GAG CTT ATA TAA GCC GAA AAA CGT C 3’。Oligo(dT)引物1 µL， AMV反转录酶1 µL，DEPC水6.5 µL。42 ℃保温1 h，置95 ℃温育5 min使AMV反转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR。目的片段大小约846 bp，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min， 94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100 V， 30 min)，凝胶成像系统摄像。真核表达栽体pIRES2-EGFP-hFasL的构建： 1% 琼脂糖凝胶电泳分离并回收 PCR 产物及 pIRES2-EGFP空载体，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，T4 DNA连接酶4 ℃连接，过夜，其产物按常规方法转化于DH5a感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养，采用HiSpeed Plasmid Midi Kit质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达一、真核表达载体pPDGF-NEP的构建（一）、材料各种Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、所有DNA marker及凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

质粒pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体购自大连Takara公司；真核表达质粒pEGFP-1、质粒pcDNA3.1(+)、质粒pCSC-SPPW-net由山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所保存。

（二）、方法2.1. PDGF启动子的获取用全血基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，根据Genbank上的PDGF 基因全序列（Genbank：HSN 10C 3,2782bp,该序列中含有一个EcoRⅠ酶切位点）设计多对引物，并在上下游外引物F/R上分别加入Bsp106及KpnⅠ酶切位点。

第一步先以基因组DNA 为模板，分别使用内引物F0/R1、F1/R进行分段PCR扩增，获得PCR产物1和PCR产物2。

第二步以PCR产物1和PCR产物2为模板，以外引物F/R进行PCR扩增，扩增产物即为2782bp的PDGF启动子序列。

第三步将上一步获得的PCR产物通过酶切插入至pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体中构建pSIMPLE-19-PDGF，并进行酶切、测序鉴定和扩增（实验步骤见图1）。

各引物序列：F0：5’-CTTACGGGCTGTGTGACCTT-3’；F：5’-ATCGATAGCA TGGAGAGGCTACAGGTAGAGT-3’；F1：5’-TCTCTGCCACTGTGCCACGCT-3’；R：5’-GGTACCGGCAGTCGATGGTTCGTCTTCACTC-3’；R1：5’-AGCGTGGCACAGTGGCAGAGA-3’。

图1 神经特异性启动子PDGF promoter的调取2.2. NEP基因的获取根据NCBI Genbank提供NEP、β-actin的基因序列，β-actin：F 5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3’，R 5’-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’；引物NEP：F5’-AAAGCTAAAAAGAAAACAG-3’，R 5’-CAGTGCCAACAAACAAA T-3’，扩增片段大小分别为395、575bp，引物为上海博亚公司合成。

基因工程常用的三种载体

基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。

载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。

在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。

下面将详细介绍这三种载体的相关信息。

1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。

质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。

质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。

质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。

例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。

质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。

2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。

噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。

噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。

噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。

噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。

通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。

另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。

3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。

人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。

人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。

真核表达载体pcDNA3-ICOSIg的构建及表达

（２０１３）３７ — ０６６４１－０４
收稿Ｅｌ朋：２０１３－０１－１９
摘要．修目Ｅｌ期．２０１３－０４．２４背景：人可诱导共刺激分子（ＩＣＯＳ）是迄今发现的重要共刺激分子家族成员，可促进激活Ｔ细胞的增殖和分泌、（２０１００８０７００５ＡＮＬＭ・ｃ）调节Ｔｈ１，１－ｈ２细胞的极化、增强依赖Ｔ细胞的Ｂ细胞功能，阻断ＩＣＯＳ共刺激信号会导致Ｔ细胞的克隆失活或克隆无反应，从而诱导肿瘤对机体的免疫逃逸。目的：构建表达ＩＣＯＳＩｇ的质粒，观察其在小鼠体内的表达。方法：克隆编码ＩＣＯＳ的胞外片段，将其与编码小鼠免疫球蛋白ＩｇＧ恒定片段（Ｉｇ）的基因融合，构建ＩＣＯＳＩｇ融合基因及其分泌型真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＩＣＯＳＩｇ，酶切鉴定重组子，测序，利用阳性脂质体载体包被ｐｃＤＮＡ３－ＩＣＯＳｌｇ转染小鼠右侧大腿肌肉组织，Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法检测血清ＩＣＯＳＩｇ水平。结果与结论：经测序鉴定证实ｐｃＤＮＡ３一ＩＣＯＳＩｇ质粒目的基因片断与Ｇｅｎｂａｎｋ上公布的ＩＣＯＳ序列完全一致，说明质粒构建成功。脂质体载体包被ｐｃＤＮＡ３．ＩＣＯＳＩｇ转染小鼠７ｄ，在小鼠血清中检测到ＩＣＯＳｌｇ的阳性表达，说明ｐｃＤＮＡ３・ＩＣＯＳｌｇ能够在小鼠肌细胞内表达。证实利用基因合成和重组技术可成功构建真核表达载

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关键词：ＣＤ－；融合蛋白；ＥＦ；ＤＲｄｌ２３ＩＥ３ＧＰｓｅ；９Ｔ细胞中图分类号：Ｑ８７２文献标识码：Ａ文章编号：１０－１９２０）９０１－０８８９（０８０－９１４０
ＣｎｔｕｔｎｏｕａｙｔｓｎｅｐｅｓｎｖｃｏｓｃｎａｎｎＩＥ．ｗｔＧＰｏｓｒｃｉｆｋｒｏｉｆｉｘｒｓｉｅｔｒｏｔｉｉｇＣＤ３ｉＥＦｏｅｃｕｏｏｈ
（＋）ＣＤ．一ＩＥ３为模板，ＣＰＲ扩增ＥＦ、ｓｅ１ＤＡ片段及人ＣＤ－基因的ＣＳＧＰＤＲｄＮＩＥ３Ｄ序列，再分别将ＥＦ、ＩＥ３及ＧＰＣＤ一
ＤＲｄ、ＩＥ３克隆入真核表达载体ｐｈｔｅＣｓｅ１ＣＤ一Ｓｕｔ —ＭＶ中。酶切、序鉴定后，磷酸钙转染入２３ｔｅＣＭＶ．Ｒｅ一ＤＥ．ａｄｔｂｅｖｈｉｘｒｓｉｎｎｏａｉａｉｎｉ９３３ａｄｐＳｕｔ．ｌＤｓｄ１ＣＩ３ｎｏｏｓｒｅｔｅｒｅｐｅｓｏｓａｄｌｃｌｚｔｏｎ２ＴｃｌｓＭｅｈｏｓ：Ｔｈｅｌ．ｔｄｅＤＮＡｅｍｅｔｆＥＧＦａｄＤｓｄ１ａｄｔｅＣＤＳｏｕｎＣＩｓｇｎｓｏＰｎＲｅｎｈｆｈｍａＤＥ．ｒｅｐｃ３ｗｅｅｒｓｅ．
显微镜观察其在２３９Ｔ细胞中的表达，并利用荧光染料Ｂｄｙ９／０ｏｉ３５３定位脂滴，讨ＣＤ－ｐ４探ＩＥ３与脂滴之间的关系。结果：酶切及ＤＡ测序证实，Ｎ重组质粒ｐｈｔｅＣ —ＧＰＣＤ一Ｓｕｔ —ＭＶＥＦ — ＩＥ３和ｐｈｔｅＣ —ｓｅ一ＩＥ３构建成功。荧ｌＳｕｔ．ＭＶＤＲｄ１ＣＤ・ｌ光显微镜观察显示，Ｓｕｔ— ＭＶＥＦ－ＩＥ３融合蛋白定位于细胞质，Ｓｕｆ —Ｍ — ｓｅ・ＩＥ３融合蛋白也ｐｈｔｅＣ．ＧＰＣＤ一ｌｐｈｔｅＶＤＲｄｌＣＤ一ｌＣ
定位于细胞质，与脂滴存在共定位关系。结论：功构建了重组质粒ｐｈｔｅＣＶＥＦ —ＩＥ３和ｐｈｔｅ并成ＳｕｌＭ．ＧＰＣＤ．ｔ．Ｓｕｌｔ—
Ｃ —ｓｅ１ＣＤ一；ＭＶＤＲｄ一ＩＥ３两者均可在２９３Ｔ细胞中表达，融合蛋白分布于细胞质，并与脂滴存在共定位关系。
ｔｅｍｌｅｏｈｌｓｉｐＧＰＣ，ｐｓｅ－ｌａｄｐＴ８（＋）ＣＤ－ｂＣ．ＴｅｉｌａｐｉｄｆｍｔｅｐａｍｄＥＦ —３ＤＲｄ１ＮｎＥ２ａｖｙｉｆｒ・ＩＥ３ｙＰＲｈｎ
论
著・
及ＤＲｄｍＩ．合基因真核ｓｅＣＤＥ３融ｌ表达载体的构建及其在２３９Ｔ细胞中的表达和定位
谷雨，李青，叶菁，李烦繁，闵婕，张丽英，马钰，李航，刘芳
（四军医大学西京医院病理科，西安７０３）第陕西１０２
摘要：目的：分别构建ＥＦＤＲｄＧＰ、ｓｅ１与ＣＤ．ＩＥ３的融合基因真核表达载体，观察其在人胚。肾上皮细胞２３９Ｔ中的表
达，定ＣＤ．亚细胞定位。方法：别以质粒ｐＧＰＣ、ＤＲｄ－及本实验室克隆得到的质粒ｐＴ８确ＩＥ３的分ＥＦ —３ｐｓｅＮ１１Ｅ２ａ
ＺＨＡＮＧｉｙｎＬ — ｉｇ，ＭＡＹｕ，ＬＩＨａｇ，ＬＩＦｎｎＵａｇ
（ｅａｔｅｔｆＰｔｏｇ，ＸｉｏｉｌｈｏｒｌａｙＭｅｉｌＵｉｒｔ，Ｘ ’ ｎ７０３，ＤｐｒｎａｈｌｙｉｇＨｓｔ，ｔｅＦｕｈＭｉｔｄｃｎｖｓｙｉａ１０２ｍｏｏｊｎｐａｔｉｒａｅｉＳａｎｉＣｉ）ｈａｘ，ｈｎａ
ａｄＤｓｅａｄｄｔｒｎｔｎｏｅｘｒｓｉｎｎｃｌａｏ９ＴｃｌｎＲｄｎｅｅｍｉａｉｆｈｉｅｐｅｓｓａｄｌａｉｔｎｉ２３ｅｓｌｏｔｒｏｏｚｉｎｌ
ＧｕＬｉｇＥＪｇＩａ・ｎＭＩｉ，ＵＹ，Ｉｎ，Ｙｉ，Ｌｎｆ，ＮＪＱｎＦａｅ
ＡｓａｔＯｊｃｖ：ＴｏｓｕｔｔｅｅｋｒｏｃｆｓｎｅｐｅｓｎｖｃｏｓｏＳｕｔ．ＭＶＥＦ．ｂｔｃ：ｒｂｅａｅｏｃｎｔｃｈｕａｙｔｕｉｘｒｓｉｅｔｆｐｈｔｅＣ．ＧＰｒｉｏｏｒｌ
维普资讯
・
９１・１
第２卷１
第９期
医学研究生学报
ＪｕｎｌｏｄｃｌＰｓｇａｕｔｓｏｒａｆＭｅｉａｏｔｒｄａｅ
・
Ｖｏ．Ｎｏ９１２１．Ｓｐ．０ｅ２０８
２００８年９月