p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

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雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响

雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响杜佩云;程龙;姜丽娜;陈立涵;林佳佳;叶棋浓;苏金为【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2015(026)003【摘要】目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响.方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据shRNA设计原则设计并化学合成特异的shRNA序列,经退火处理后与pSIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DHSα后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和qRT-PCR检测ERα在mRNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量.结果:经测序分析表明目标shRNA序列成功插入载体,qRT-PCR检测稳定克隆,发现该shRNA能有效抑制目的基因的mRNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制.结论:设计并构建的抑制ERα的shRNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础.【总页数】4页(P325-328)【作者】杜佩云;程龙;姜丽娜;陈立涵;林佳佳;叶棋浓;苏金为【作者单位】福建农林大学生命科学学院,福建福州350002;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;福建农林大学生命科学学院,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.雌激素受体α高表达慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙／成骨分化的影响 [J], 卢亚蝶;闫明;于金华2.雌激素受体α-shRNA慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙/成骨向分化的影响[J], 马姝;闫明;吴锦涛;王子露;张光东;于金华3.靶向活化转录因子6的短发夹RNA重组腺病毒载体构建及对猪瓣膜间质细胞增殖与凋亡的影响 [J], 田军;刘晓红;韩林4.钙网织蛋白-短发夹RNA慢病毒载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中钙网织蛋白表达的影响 [J], 高树峰;杨明福;张克辉;游龙贵;王富华;王心涛;刘遗斌;罗冬;蔡云香5.HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响 [J], 罗晓红;曾雯;巨容因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

细胞突变体筛选的方法(一)

细胞突变体筛选的方法(一)细胞突变体筛选的方法1. 介绍细胞突变体是指细胞基因组中发生的突变导致表型变化的个体。

研究细胞突变体有助于理解基因对细胞功能和表型的影响。

本文将介绍几种常用的细胞突变体筛选方法，以帮助读者深入了解这一研究领域。

2. 随机突变体随机突变体是指通过诱导机制或自发突变引起的细胞基因组的突变。

下面列举几种常用的随机突变体筛选方法：•化学诱导：使用化学物质（如EMS）诱导细胞基因组发生突变。

•辐射诱导：使用电离辐射（如X射线）或紫外线辐射诱导细胞突变。

•基因突变库：构建基因突变库，利用插入片段、合成基因或随机插入方式制造大量突变体细胞进行筛选。

3. 特定目标突变体特定目标突变体是指针对具体基因或基因组区域进行的突变体筛选。

以下是几种常见的特定目标突变体筛选方法：•CRISPR/Cas9系统：利用CRISPR/Cas9系统定向编辑细胞基因组，实现对目标基因的突变。

•RNA干扰：利用小干扰RNA或慢病毒载体等工具，抑制或过表达特定基因，诱导细胞基因组发生突变。

•基因组编辑：通过基因组编辑技术（如基因敲除、基因修饰等），实现对目标基因的突变。

4. 高通量筛选方法高通量筛选方法可以快速筛选大量细胞突变体，提高筛选效率。

以下是一些常见的高通量筛选方法：•流式细胞术：利用流式细胞术技术，对多个样品的突变体细胞进行快速筛选。

•高通量测序：通过高通量测序技术，对细胞突变体的基因组进行全面分析和筛选。

•转录组学分析：通过转录组学技术，对细胞突变体的基因表达进行全面筛选和分析。

5. 结论细胞突变体的筛选方法多种多样，每种方法都有其适用范围和优缺点。

研究者可以根据实际需求选择合适的方法，以达到高效、准确地筛选细胞突变体的目的。

以上就是针对细胞突变体筛选的方法的详细介绍。

希望本文对读者在相关研究中有所帮助。

一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用[发明专利]

专利名称：一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用
专利类型：发明专利
发明人：卢海
申请号：CN201811480813.X
申请日：20181205
公开号：CN109517821A
公开日：
20190326
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种靶向PRIM1基因的干扰RNA、慢病毒载体及其应用，所述RNA干扰序列能够抑制肿瘤细胞的生长，由其构建的的慢病毒载体能够抑制PRIM1基因在mRNA水平的表达，可以用于制备抗肿瘤药物，为后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中具体的作用机制提供了一种切实有用的方法。

申请人：卢海
地址：512000 广东省韶关市武江区惠民南路133号粤北人民医院
国籍：CN
代理机构：广州骏思知识产权代理有限公司
代理人：潘雯瑛
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载小干扰RNA纳米粒对乳腺癌细胞的杀伤作用

载小干扰RNA纳米粒对乳腺癌细胞的杀伤作用杨飞飞;黄伟;李云飞;柳珊;金明姬;金帅星;高钟镐【期刊名称】《国际药学研究杂志》【年(卷),期】2013(40)5【摘要】目的研究靶向生存素的载小干扰RNA (siRNA)纳米粒对小鼠乳腺癌细胞的体外杀伤作用.方法复凝聚法制备靶向生存素的载siRNA纳米粒,采用动态光散射粒度仪和透射电镜对纳米粒的粒径、电位和形态进行研究；应用划痕实验和CCK-8方法考察载siRNA纳米粒抑制乳腺癌细胞增殖的效果；倒置显微镜和流式细胞仪检测载siRNA纳米粒对4T1细胞凋亡的影响.结果所制备的载siRNA球形纳米粒平均粒径为202.2 nm,多分散系数0.121,Zeta电位为+18.58 mV；划痕实验结果显示,转染48 h后,裸siRNA组由于细胞增殖,划痕愈合,而纳米粒组细胞增殖受到抑制,划痕宽度没有变化；CCK-8实验结果表明,转染后24h纳米粒对4T1细胞增殖的抑制率可达45.4％,较裸siRNA组(约5.5％)显著增高(P＜0.05)；凋亡检测结果显示,纳米粒组凋亡细胞达(98.77±0.61)％,与裸siRNA组(6.66±0.44)％相比,有显著统计学差异(P＜0.05).结论以生存素为靶点的载siRNA纳米粒对小鼠乳腺癌细胞有较强的杀伤作用.【总页数】5页(P594-598)【作者】杨飞飞;黄伟;李云飞;柳珊;金明姬;金帅星;高钟镐【作者单位】100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室;100093北京,中国医学科学院药用植物研究所;100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室;100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室;100050北京,中国医学科学院生物技术研究所;100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室;100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室;133000延吉,延边大学附属医院;100050北京,中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R943.42;R979.1【相关文献】1.载阿霉素葡聚糖纳米粒的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用研究 [J], 黄颖烽;古维立;李志花;陈汝娟;周嘉嘉;周泉波;郭宁2.多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/Adr中体外转录的小分子干扰RNA(siRNA)对mdr1基因的干扰作用 [J], 袁亚维;孙爱民;刘英3.特异性小干扰RNA沉默Itch基因增强小鼠T细胞对MFC胃癌细胞的免疫杀伤作用 [J], 粟英;兰亚明;卢义琼;田国红;胡烈献4.壳聚糖纳米粒介导人表皮生长因子受体2小干扰RNA抑制乳腺癌细胞迁移 [J], 张永成;武晓英;陈晓兰5.mPEG-CS纳米粒介导livin与survivin小干扰RNA杀伤结肠癌细胞 [J], 张阳德;杨柳青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

MicroRNA与乳腺癌患者的化疗敏感性

MicroRNA与乳腺癌患者的化疗敏感性近年来，乳腺癌已成为全球女性最常见的恶性肿瘤之一。

尽管现有的化疗方案在治疗乳腺癌方面取得了一定的疗效，但仍然存在许多患者对化疗药物不敏感的情况。

因此，寻找能够预测乳腺癌患者化疗敏感性的生物标志物显得尤为重要。

近年来，越来越多的研究结果显示，MicroRNA在乳腺癌患者的化疗敏感性中发挥着重要作用。

MicroRNA是一类非编码RNA分子，通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）相互作用，调控基因的表达。

越来越多的研究发现，MicroRNA在乳腺癌的发生、发展和化疗耐药中起着重要作用。

在这些研究中发现了一些与乳腺癌患者化疗敏感性相关的MicroRNA。

例如，miR20a、miR21、miR125b、miR145、miR155、miR222等MicroRNA在乳腺癌患者的化疗敏感性中起着重要作用。

以miR20a为例，研究发现，miR20a在乳腺癌患者中的表达水平与化疗敏感性密切相关。

在化疗敏感的乳腺癌患者中，miR20a的表达水平较低，而在化疗耐药的患者中，miR20a的表达水平较高。

进一步研究发现，过表达miR20a能够显著降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，而过抑制miR20a则能够提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。

这表明miR20a可以作为预测乳腺癌患者化疗敏感性的生物标志物。

除了miR20a之外，其他MicroRNA如miR21、miR125b、miR145、miR155、miR222等也在乳腺癌患者的化疗敏感性中起着重要作用。

例如，研究发现，miR21在乳腺癌患者中的表达水平与化疗敏感性呈负相关。

在化疗敏感的乳腺癌患者中，miR21的表达水平较低，而在化疗耐药的患者中，miR21的表达水平较高。

过表达miR21能够显著降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，而过抑制miR21则能够提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。

这表明miR21也可以作为预测乳腺癌患者化疗敏感性的生物标志物。

p300 RNA 干扰慢病毒载体的构建及其在 CNE-2细胞中的表达

p300 RNA 干扰慢病毒载体的构建及其在 CNE-2细胞中的表达廖志伟;罗键雄;喻芳;余宏伟;庄雅靖;周同冲;刘孟忠【摘要】目的：构建 p300基因 RNA 干扰慢病毒载体获得稳定感染的人鼻咽癌CNE-2细胞株，以观察 CNE-2细胞中 p300的表达及其功能。

方法设计 p300基因特异性 RNA 干扰靶序列，与经 HpaI 和 XhoI 酶切后的载体连接，产生重组慢病毒质粒 pLL-GFP-Puro-shp300，筛选阳性克隆，测序鉴定，与慢病毒包装载体共转染293T 细胞，包装产生慢病毒，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果pLL-GFP-Puro-shp300慢病毒RNA 干扰载体经酶切和测序鉴定证实准确连接测序正确，且包装出来的病毒纯化后滴度达107 TU·mL -1。

RT-qPCR、Western blot 结果显示感染后 p300 mRNA 及蛋白水平显著下降，证明重组慢病毒对CNE-2细胞p300基因表达有明显沉默作用。

结论成功构建靶向 p300基因 RNA 干扰慢病毒载体，为进一步研究 p300在鼻咽癌发生过程中的作用奠定基础。

%Objective To construct a lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering,and to establish hu-man nasopharyngeal carcinoma cells with stably inhibited p300. Methods Two pairs of small hairpin RNA specific for p300 were designed,synthesized and cloned into the pLL3. 7-GFP-Puro vector. Then,the lentivirual plasmid was trans-fected with the other two packaging plasmids into 293T cells to product and amplify lentivirus. After the infection of lentivirus mediated siRNA-p300,the mRNA and protein expression of p300 were observed. Results The lentivirus vector of siRNA-p300 was constructed successfully. The virus titres were above 107 TU·mL - 1 . pLL-GFP-Puro-shp300 was effective to inhibit p300expression in mRNA and protein levels of CNE-2 cells. Conclusion A lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering is successfully constructed. This study lays a foundation for further study of mechanisms of p300 in the nasopharyngeal carcinoma.【期刊名称】《肿瘤基础与临床》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】5页(P464-468)【关键词】p300;鼻咽癌;慢病毒载体【作者】廖志伟;罗键雄;喻芳;余宏伟;庄雅靖;周同冲;刘孟忠【作者单位】广州医科大学附属肿瘤医院，广东广州 510095; 中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东广州 510060;广州医科大学第三临床学院，广东广州 510180;广州医科大学附属肿瘤医院，广东广州 510095;广州医科大学附属肿瘤医院，广东广州 510095;广州医科大学附属肿瘤医院，广东广州 510095;广州医科大学附属肿瘤医院，广东广州 510095;中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东广州510060【正文语种】中文【中图分类】R739.63;R730.23p300是人体重要的乙酰基转移酶，在食管癌[1]、肝癌[2]、乳腺癌[3]、结直肠癌[4]等恶性肿瘤组织中表达明显增高，提示p300在肿瘤的形成、增殖、转移中起重要作用。

MicroRNA生物标志物在乳腺癌中的研究

MicroRNA生物标志物在乳腺癌中的研究作为一名专注于基因表达调控的研究者，我深入参与了microRNA生物标志物在乳腺癌中的研究。

这项研究对于我们了解乳腺癌的发生发展，以及为患者提供更精准的治疗方案具有重要意义。

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，每年都有大量的女性被诊断出患有乳腺癌。

然而，乳腺癌的早期诊断仍然是一个挑战，因为它的症状在早期往往不明显。

因此，寻找一种敏感性和特异性都较高的生物标志物对于乳腺癌的早期诊断至关重要。

近年来，microRNA作为一种新兴的非编码RNA分子，在乳腺癌等肿瘤的诊断、预后评估和治疗中显示出巨大的潜力。

microRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，可以通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）相互作用，调控基因的表达。

越来越多的研究表明，microRNA的异常表达与许多疾病，包括乳腺癌的发生发展密切相关。

在我们的研究中，我们通过高通量测序技术对乳腺癌患者的组织和血清中的microRNA进行了全面的检测。

我们发现，与正常组织相比，乳腺癌组织中有许多microRNA的表达发生了显著的变化。

其中，一些microRNA在乳腺癌组织中的表达水平明显升高，而另一些则明显降低。

除了在乳腺癌的诊断和预后评估中的潜在应用，我们的研究还发现，一些microRNA可以作为潜在的治疗靶点。

例如，我们发现，通过抑制microRNA21的表达，可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖，促进其凋亡，从而抑制乳腺癌的发展。

因此，我们的研究为乳腺癌的治疗提供了新的思路。

总的来说，我们的研究表明，microRNA生物标志物在乳腺癌的诊断、预后评估和治疗中具有重要的应用价值。

我们相信，随着研究的深入，microRNA生物标志物将在乳腺癌的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。

重点和难点解析：在我们的研究中，有几个关键的细节需要特别关注。

microRNA作为非编码RNA分子，在乳腺癌中的调控作用及其潜在的应用价值是本研究的核心。

小分子干扰RNA非病毒纳米载体的设计进展

ｓ入细胞，可使内源性细胞内的核酸酶降解；（３）ｓｉＲＮＡ的脱靶效应；４）ｓｉＲＮＡ的免疫原性刺激Ｊ。随着ＲＮＡｉ在研究基ｍＲＮＡ降解和基因沉默，这种转录后的基因沉默机（
新视野
ＮｅｗＨｏｎ ∞ｎｓ
小分子干扰ＲＮＡ非病毒纳米载体的设计进展
郑荣上海市普陀区妇婴保健院，上海２０００６２
［摘要］小分子干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓｉＲＮＡ）进入临床应用最关键的环节是如何有效通过药物递送系统将ｓｉＲＮＡ递送到特异性靶细胞或靶组织。非病毒纳米载体递送系统具有低的免疫原性、良好的靶向性和生物相容性，是近年来国内外药剂
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮｏｎ－ＶｉｒａｌＮｍｘｏｍｅｔｍ＂ＶｅｃｔｏｒｓＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｍｍｎｆｏｒＳｍａｌｌＩｎｌｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ
ＺＨＥＮＧＲｏｎｇＷｏｍｅｎａｎｄＣｈｉｌｄｒｅｎ ’ ＳＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｕｔｕｏＤｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６２，Ｃｈｉｎａ
、
Ｉ与内源］￣ｍＲＮＡ序列相对应的正义ＲＮＡ
的ｓｉＲＮＡ在体内不能快速透过血管内皮、滞留于脾
Ｉ和反义ＲＮＡ组成的双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ — 脏等血液储存场所、易于被肾小球滤过、以及被

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［Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｆｏｒｐ３００ｓｍａｌｌ — ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），ａｎｄｔｏｄｅｔｅｃｔ
ＣＨＥＮＺｈｉ — Ｄａ，ＤＩＮＧＬｉ — Ｈｕａ。，ＺＨＡＮＧＹａ — Ｎａｎ２，ＬＩＵｉｆｅ。，ＺＨＵｉｆｅ，ＹＥＱｉ — Ｎｏｎｇ２，ＷＥＩＢｏ
１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３；２．ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０；Ｃｈｉｎａ
胞后能有效抑制ｐ３００基因的表达，且能促进ＺＲ７５ — １细胞的生长，表明构。
［关键词］ｐ３００基因；小干扰ＲＮＡ；慢病毒载体［中图分类号］Ｑ７８［文献标识码］Ａ［文章编号］１００９ — ０００２（２０１４）０５ — ０６２１ — ０４
研究报告
ｐ３００基因小干扰ＲＮＡ慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ＺＲ７５ — １细胞的影响
陈志达，丁丽华，张亚楠，刘婕，朱杰，叶棋浓，卫勃
１．解放军总医院普通外科，北京１００８５３；２．军事医学科学院生物工程研究所，北京１００８５０
［摘要］目的：构建ｐ３００基因的小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）慢病毒表达载体，检测其对ｐ３００蛋白表达的干扰，以及对乳腺癌细胞ＺＲ７５ — １生长的影响。方法：利用ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）技术设计并合成针对ｐ３００基因的ｓｉＲＮＡ，并将其克隆到ｓｉＲＮＡ表达载体ｐＳＩＨ— Ｈ１上，经酶切和测序验证，用２９３Ｔ人胚肾细胞包装ｐ３００ｓｉＲＮＡ慢病毒，感染乳腺癌细胞ＺＲ７５ — １，建立敲低ｐ３００表达的稳定细胞株，通过实时定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检验ＲＮＡｉ的干扰效果，利用细胞生长实验检测ｐ３００ｓｉＲＮＡ对ＺＲ７５－１细胞生长的影响。结果：酶切和测序证明构建了ｐ３００ｓｉＲＮＡ真核表达载体；实时定
生
技术
ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＯＧＹＶｏｌ－２５３Ｎ。Ｉ、ｏ．・５）ｓｅｐ． ’ ，２ … ０１４・ｒＩＴＩＨＮ０Ｌ
．
通讯ｖ，
６２１
ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１００９－０００２．２０１４．０５．００４
Ｃｏ — ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ，ＷＥＩＢｏ，Ｅ — ｍａｉｌ：ｗｅｉｂｏ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｎｒ；ＹＥＱｉ — Ｎｏｎｇ，Ｅ — ｍａｉｌ：ｙｅｑｎ６６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎｒ
量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明构建的ｓｉＲＮＡ能有效抑制ｐ３００基因的表达，并建立了敲低ｐ３００表达的稳定细胞株；细胞
生长实验证实ｐ３００ｓｉＲＮＡ可有效促进ＺＲ７５ — １细胞的生长。结论：构建了ｐ３００基因的ｓｉＲＮＡ真核表达载体，转染细
ＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｆｏｒｐ３００Ｓｍａｌｌ－－ＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡａｎｄｉｔｓＥｆｆｅｃｔｏｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＺＲ７５－１ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ
ｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒＺＲ７５一ｌｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｐ３００ｓｉＲＮＡｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｃｏｎｓｔｕｃｒｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｈｕｍａｎｐ３００ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｕｓｉｎｇａｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ。Ａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｐＳＩＨ— Ｈ１一ｐ３００