抗体酶的研究及其应用
抗体酶的制备及应用
Ｃ ｉ ａ ｓ ｉ ｉ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｏｇ ｅ ｅ ｈ ｎ ｃ ｅ １ ｎ ｅ ｈ ｏ］ ｙ Ｒ ｖｉ ｗ ｃ●Ｉ 源自抗体 酶 的制 备及 应 用
吕璨 慧
（ 国矿 业 大学 中
温
哲
徐州 ２１ １ ） ２ １６
江苏
Ｉ Ｎ 要】 体酶 既 具有相 应 的免 疫活 性， 抗 又具有 生 物催 化活 性 。抗体 酶具 有 抗体 种类 繁 多， 但 能催化 一 些天 然酶 能 催化 的反 应， 不 而且 还能 催化 一些 天然 酶不 能催化 的反 应等优 点 ，因此 在有 机合 成 、医 学、戒 毒 、前 药生产 等领 域 都有着 广泛 的利 用 。本文主 要 就抗 体酶 的催 化机 理、制 备方法 、具 体应用 等几 方面 展开讨 论 。 ［ 关键 词】 体酶 制 备方 法 抗 中图分 类号 ：９ ２ Ｒ ７ 应用 文 献标 识码 ： Ａ
的催化性抗 体 。 ３ 抗 体酶 的 应 用 口 ２ １ ３ １ 在 有机合 成领 域 的应用 ．
１抗体 一发 晨 历程 【 １ 】 １８ ９ ４年列 那 （ ｅｎ ｒ 进一 步推 测 ：以过渡 态类 似 物作 为半 抗 原，则 其 Ｌｒ ｅ） 诱发 出 的抗体 即与该 类似 物有 着互 补 的构象 ，这种 抗体 与底 物结 合后 ，即 可 诱导底 物进 入过 渡态 构象 ，从 而引起 催 化作用 。根据 这 个猜想 列那 和 苏尔滋 （． ． ｃｕ ｔ） Ｐ Ｃ Ｓｈ ｌ ｚ 分别领 导各 自的研究 小组 独立 地证 明 了：针对 羧酸 酯水 解 的 过渡态 类似 物产 生 的抗体 ，能催 化相 应 的羧酸 酯和碳 酸 酯 的水 解 反应 。１８ ９６ 年美 国 Ｓ ｉｎ ｅ ｃ ｅ ｃ 杂志 同时发 表 了他们 的发 现 ，并将这 类 具催化 能力 的免 疫球 蛋 白称 为 抗体 酶 或 催 化 抗体 。 ２抗体 群的 村 鲁方 法 ２ １ 杂交癌 技术 ［ ． ５ 杂交 瘤技术 的基 本原 理是 用不 能在培 养液 中 生长的但 能产 生抗 体 的脾脏 细胞 ，与能 在培养 液 中生长 的骨髓 瘤 细胞进 行 融合 ，融合 得到 的杂 交细胞 既 能产生 抗体 又能在 体外 培养 ，通过 选择 培养 ， 以获取 能产 生单 克隆 抗体 的杂 交 瘤细 胞 。 再把 这些 细胞 单克 隆化 ， 即繁殖 成母 体 的同一 细胞 或形 成菌 落 。 这 些 菌落 能够产 生单 一均匀 的 抗体 ，可用 于进 行单 克隆 抗体 的扩 大生 产 。对 这 些菌 落用 酶联免 疫 吸附法 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 等方 法加 以筛选 。 该制备 方法 的关 键是 要有 合 适而 稳定 的过 渡态 模拟 物 作半 抗 原 ，以产 生与过 渡 态 高度 亲和 的抗 体 酶 。 由于大 多数反应 过 渡态类 似物 的分 子量 较低 ， 即所谓 的半 抗原 ，他们 本身 免 疫 原性很 弱 ，必须 与某种 载体 偶联 才能 表现 免疫 原性 。本方 法所 得到 的抗 体 酶 的催 化 能 力 的 高低 ，在 很 大 程度 上 取 决 于 化 学模 型 物 的 设 计 。 ２ ２ 抗体 结合 部位 修饰 法 ． 将 催化 基 团或辅 助因子 引入 到抗 体 的抗 原 结合 部位 ，一 般可采 用 两种 方 法： 即选择 性 化学 修饰 法 和 基 因工程 定 点 突变 法 。 （） １化学 修饰法 抗 体酶 可 以用 化 学修饰 的方法 加 以改造 。 抗 体酶进 行 结构修 饰 的关键 对 是找到一 种吻合 的方法 在抗体 结合 位置或 附近 引入酶 的催化 基 团或辅助基 团， 如果引人的催化基 团与底物结合部位取向正确空间排布恰到好处，就能产生 高活力 的抗 体酶 。 为提 高抗 体酶 的催 化能 力 ， 可采用 邻 近效应 ， 电催化 ， 静 应 变 ，功 能 团催 化 等 方 法 ，在 抗 体 结 合 位 点 引 入 催 化 基 团 。
抗体酶
抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去 设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计 制作酶。它是酶工程的一个全新领域。利用动 物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到 一系列高度专一性的抗体酶，使抗体酶不断丰 富。随之出现大量针对性强、药效高的药物。 立体专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体 专一性的药物成为现实。以某个生化反应的过 渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶， 以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可 有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防 止病毒与靶细胞结合。抗体酶的固定化已获得 成功，将大大地推进工业化进程。
其它名称 反应可逆 二烯合成 [4+2]环加成 二烯 dienes 亲二烯体 dienophiles
环己烯衍生物
R
O C R(H) W CO2R(H) CN NO2
（吸电子基）
有利因素:
G
OR NHR
（给电子基）
Diels-Alder反应机理
G W + G G
六员环过渡态 协同机理
G
G W
W
2、抗体结合位点化学修饰法： 抗体酶和酶一样也可以用化学修 饰法加以改造。对抗体酶进行结 构修饰的关键是找到一种温和的 方法在抗体结合位置或附近引入 具有催化功能的基团。游离巯基 就是适合的基团之一，它具有高 亲核性，易于氧化，及能通过二 硫化物进行交换反应或亲电反应 而选择性修饰的特点
3 . 引入辅助因子法
结果按这种设想所得到的抗体不仅使酯 的水解速度增加了103～104倍，而且还具 备专一性、 pH依赖性及被抑制剂抑制等 酶的基本特性。抗体酶的催化活性虽然 仍比天然酶小，但这意味着可按人的意 愿来设计和生产具有已知结合专一性的 蛋白质，在理论上和实践上均有重要意 义。美国已将抗体酶技术商品化，在第 一批具有应用价值的抗体酶中有与蛋白 酶相似的抗体，可在特定的氨基酸序列 上切割蛋白质，从而建立具有各种专一 性的切割蛋白质抗体酶库，就像限制性 核酸内切酶库一样供研究者选用。
抗体酶
制备方法
• 1、杂交瘤技术 • 经体内免疫后再进行细胞融合是制备抗体酶的一种传统方法。 杂交瘤技术的基本原理是用不能在培养液中生长的但能产生抗 体的脾脏细胞，与能在培养液中生长的骨髓瘤细胞进行融合， 融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养，通过选择 培养，以获取能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。再把这些细胞 单克隆化，即繁殖成母体的同一细胞或形成菌落。这些菌落能 够产生单一均匀的抗体，可用于进行单克隆抗体的扩大生产。 对这些菌落用酶联免疫吸附法等方法加以筛选。该制备方法的 关键是要有合适而稳定的过渡态模拟物作半抗原，以产生与过 渡态高度亲和的抗体酶。由于大多数反应过渡态类似物的分子 量较低，即所谓的半抗原，他们本身免疫原性很弱，必须与某 种载体偶联才能表现免疫原性。本方法所得到的抗体酶的催化 能力的高低，在很大程度上取决于化学模型物的设计，现在应 用的设计策略包括：诱导和转化设计，反应免疫，“潜过渡态” 半抗原设计等等。
• 2、抗体结合部位修饰法 • 将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，一 般可采用两种方法：即选择性化学修饰法和基因工程定 点突变法。抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加 以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键，是找到一种吻 合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基 空间排布恰到好处，就能产生高活力的抗体酶。为提高 抗体酶的催化能力，可采用邻近效应，静电催化，应变， 功能团催化等方法，在抗体结合位点引入催化基团。基 因工程定点突变法是利用位点专一性突变引起抗体结合 部位氨基酸的改变，能在抗体结合部位换上有催化作用 的氨基酸，进而改变抗体酶的催化效率。目前，定点突 变的方法己成为提高抗体酶活性的一种常规方法。
• 3、克隆免疫反应因子的基因 • 通过PCR技术克隆出全套免疫球蛋白的可变位点 使它们随机地将基因的轻重链结合，这些含上利用了免疫因子的多样性， 通过这种方法我们可从上百万种可能性中选择 抗体酶。[1]
抗体酶
抗体酶综述陈璇【摘要】抗体酶是一类以过渡态类似物，为半抗原，可诱导免疫系统产生具有类似天然酶催化活性的免疫球蛋白。
抗体酶既具有抗体的高效选择性，又能像酶那样高效催化化学反应，开创了催化剂研究的崭新领域。
本文从抗体酶的发展历史、作用原理、制备、应用及研究展望多个角度进行综述。
【关键词】抗体酶；发现史；作用原理；制备；现状及应用前景抗体酶抗体酶(abzyme)，又称催化抗体(cat·alytic antibody)，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应。
抗体与酶相似，它们都是蛋白质分子．酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能态的过渡态分子相结合，而抗体则与抗原(基态分子)相结合。
抗体与天然酶相比，最大的优点在于抗体的种类是巨大的，免疫系统可以拥有10 种抗原特异性不同的抗体分子。
制备成功的抗体酶不但能催化一些天然酶能催化的反应，而且还能催化一些天然酶不能催化的反应。
抗体酶的发现早在l948年，美国斯坦福大学荣誉退休化学教授l』_波林(LinusPaulin'f)就提出过渡态理论(transition state theory) [2]。
这一理论认为，酶之所以具有催化能力，是因为它与反应分子(底物)的牢固结合的方式，有利于反应中的过渡态(transition state)的结构。
而这种结构会迅速重新排列成该反应的产物。
任何有利于过渡态，而不是其它可能的结构的因素，都能加快化学反应速度。
1 969年，布兰戴斯大学生物化学家w ·詹克斯(w ·Jenks)进一步发展了这一理论。
他和几位美国科学家认为，如果波林的观点是正确的话，那么利用某一反应过渡态的模拟物作为免疫原，则会得到催化该反应的抗体。
这种抗体能特异地识别化学反应的过渡态，并利用其结合能降低反应的活化能。
抗体酶及其应用2016年
抗体酶及其应用左摘要：抗体酶（abzyme），又叫催化抗体（catalytic antib）,是具有催化活性的免疫球蛋白。
自1986年成功获得抗体酶后，相关研究激增。
但由于抗体酶的催化效率低，制备困难，研究热情渐渐消退。
一开始的研究目的主要是工业应用，但抗体酶催化效率太低而放弃了。
现有的研究主要集中在抗体酶在临床医学方面的应用，因其具有高特异性、长半衰期、低免疫源性和高可塑性。
关键词:抗体酶催化抗体免疫球蛋白1.抗体酶的出现抗体酶就是有催化活性的抗体。
抗体指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
鲍林(Pauling) 在1946 年用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。
1984年Lerner设想可以通过对过渡态类似物产生抗体，抗体会诱导底物进入过渡态，使反应进行。
根据这个设想，Lener和P. C. Schultz分别独立地证明：对所酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体有催化相应羧酸酯和碳酸酯的反应。
这种有催化活性的抗体被命名为抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalyticantibody）。
2.抗体酶的制备我们简单地把抗体酶的制备分为生物学方法和化学方法(Figure 1)。
Figure 1抗体酶制备化学方法就是设计反应的过渡态类似物，把类似物作为半抗原，连接到恰当的载体上，形成抗原，通过动物免疫作用产生抗体，再筛选。
生物学方法主要有两种，一种是用酶做抗原，筛选出与酶特异性结合的抗体，用该抗体作为抗原，再产生能和底物过渡态结合的抗体。
相当于把酶拷贝了一份。
所以又称之为拷贝法。
另一种是用酶的抑制剂做抗原，产生的抗体可能和底物结合。
另外还有一些方法，如定点突变蛋白设计抗体；化学修饰抗体；抗体基因组合文库法等等。
3.抗体酶的应用随着研究的深入，尽管抗体酶的催化效率(k cat/K M)不断提高，但是抗体酶的催化效率（102-104 M-1s-1）远低于天然酶（106-108 M-1s-1）（Xu et al. 2004; Rao and Wootla2007）。
抗体酶及其应用
抗体酶是具有催化性质的抗体，它同时具备抗体和酶的特征，可催化多种化学反应，如酰基转移、酯水解、酰胺水解、重排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。
用人工方法合成的抗体酶，可作为研究酶作用机理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应，更为开发具有高度选择性的药物指明了方向。
本文对抗体酶的研究开发思路和历史、催化反应类型、制备方法及发展前景作了综述。
关键词抗体酶过渡态类似物催化反应抗体酶是具有催化性质的抗体。
1986年，Lerner和Schultz [1] 同时在美国《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。
Abzyme 本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalytic antibody）。
抗体有极高的亲和力，解离常数在10 ~10 mol/L，这与酶相似，但无催化活力。
酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。
抗体酶同时具备了抗体和酶的特征，应用前景十分广阔。
一、抗体酶设计的研究思路及历史过程1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。
他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。
这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10 ~10 s，实际中极难捕获。
同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。
既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物；还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。
抗体酶在临床上的应用研究
抗体酶在临床上的应用研究抗体酶在临床上的应用研究已经成为近年来医学领域的热点话题。
抗体酶作为一种先进的生物技术手段，在医疗领域中具有广泛的应用前景。
本文将从抗体酶的定义、原理、临床应用等方面展开探讨，以期为读者提供全面了解抗体酶在临床上应用研究的信息。
抗体酶的概念首次出现在20世纪70年代，是将抗体与酶相结合而形成的复合物。
抗体是机体免疫系统的重要组成部分，可以识别并结合特定的抗原，从而发挥免疫作用。
而酶则是一种具有催化作用的蛋白质，可以加速化学反应的进行。
将抗体与酶结合后，形成的抗体酶具有抗体的特异性和酶的催化活性，具有更广泛的应用前景。
抗体酶的原理主要是利用抗体的特异性结合性质，使其能够精准结合到目标生物分子上，然后利用酶的催化作用对目标生物分子进行特异性的降解或转化。
这种双重功能的组合使得抗体酶在医学领域中具有广泛的应用价值。
在临床上，抗体酶可以用于诊断、治疗以及疾病监测等多个方面。
在诊断方面，抗体酶可以作为诊断试剂用于检测特定疾病或病原体。
例如，酶联免疫吸附试验（ELISA）就是一种常用的抗体酶诊断方法，它可以检测血清中的抗体或抗原，用于诊断各种传染病、自身免疫性疾病等。
抗体酶还可以应用于流式细胞术、免疫组织化学等诊断技术中，为临床诊断提供更为准确和快速的手段。
在治疗方面，抗体酶也发挥着重要作用。
目前，抗体酶疗法已经成为肿瘤治疗的重要手段之一。
将酶与抗肿瘤特异性抗体结合后，可以实现对肿瘤细胞的靶向治疗，提高治疗的有效性，减少对正常细胞的毒副作用。
同时，抗体酶还可以用于抗体依赖性细胞毒性（ADCC）及细胞毒性T细胞（CDCC）等免疫细胞的激活，进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用。
除此之外，抗体酶还可以用于疾病监测、药物评价、分子影像学等领域。
通过结合具有特异性的抗体和高效的酶活性，可以实现对疾病相关分子的快速检测和定量分析，为疾病早期诊断和治疗监测提供重要参考依据。
此外，在新药研发和评价中，抗体酶也可以用于筛选特异性受体结合配体，并对药物的药代动力学等进行评估，为药物研究与开发提供重要支持。
抗体酶
如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微 环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有 可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。
制备方法 诱导法
基因工程法 拷贝法 导入法 修饰法
一、抗体的一些基本概念
单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。
特异蛋白 半抗原
抗原抗体
抗原抗体
抗体酶
抗体酶模型
抗体酶的特性
一种对酶促反应过渡态特异的抗体 结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用， 又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。
1、能催化一些天然酶不能催化的反应 有许多化学反应还没有已知酶催化进行 抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性 抗体酶可以根据需要人工裁制
致敏的B淋巴细胞
骨髓瘤细胞 （myeloma）
（能够分泌特异性的抗体 ，
（不能分泌特异性的抗体，
不能在体外长期生存 ）
但能在体外长期生存）
阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)
1
（既能分泌特异性抗体，
2
又能够在体外长期生存）
克隆化培养
12
（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）
22 2
生产单克隆抗体
酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的 亲和力。
能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质
根据Pauling理论 ，William Jencks于1969年预言： 若能找到对应某反应过渡态的抗体，将其加入该反应体系 中，就可观测到这个抗体对该反应的催化效应。
这就意味着 ，抗体一旦能与过渡态相结合 ，它就具 有酶的性质 。
寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体
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抗体酶的研究及其应用郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：抗体酶又称催化性抗体，是具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，它可促进许多用普通化学方法很难完成，或者天然酶尚未能催化的新奇转变，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
本文就催化抗体的结构、性质、产生方法、筛选方法、酶学特征及应用进行了综述。
关键词：抗体酶；催化；高度选择性；催化剂；实用价值；结构抗体酶是具有催化性质的抗体。
从1883年Payen和Personz发现第一个酶以来，自从1986年Schultz和Lerner首次证实由过渡态类似物为半抗原，通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性以来，直至20世纪80年代初期，整整一个半世纪，发现的酶已经超过了4000种[1]。
1986年，Schultz和Lerner 同时在《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。
Abzyme本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体。
酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。
抗体酶显示出在许多领域的潜在应用价值，包括许多困难和能量不利的有机合成反应，前药设计，临床治疗，材料科学等多个方面。
抗体酶这种兼具抗体和酶的性质的崭新物质，它集生物学、免疫学、化学于一身，它的发现打破了只有天然酶才有的分子识别和加速催化反应的传统观念，为酶工程学开创了新的领域，同时也为验证天然酶的催化机制，进行酶的人工摸拟，以及研究天然酶催化作用的起源提供了很好的帮助。
抗体酶的应用前景是十分广阔又充满希望的。
1.抗体酶的发展历史抗体酶(abzyme),又称催化抗体(catalytic antibody),是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体,它既具有相应的免疫活性,又能像酶那样催化某种化学反应[2]。
1946年,Linus Pauling阐明了酶的催化实质,同时指出稳定的反应过渡态类似物可以竞争性抑制酶活性的实质。
酶之所以具有催化活力是因为其和反应的过渡态(底物激活)发生特异性结合,形成酶-底物复合物,大大降低了反应的活化能,从而加速了反应速率。
酶产生的生物局限性是酶催化高效性无法普遍化的局限因素,突破限制就能人为地控制酶的产生。
高等动物的免疫系统为我们提供了方便[3]。
1969年,Jencks提供免疫诱导产生抗底物基态的抗体,该抗体具有类似酶的催化活性,这个抗体酶设想的提出,使得任何一个化学反应构造一个专一性催化酶成为可能。
然而在抗体酶的研制中遇到了两个问题:1.底物基态瞬间存在,无法提取。
根据Pauling的酶的竞争抑制实质,可以构造过渡态的稳定类似物作为实际抗原。
2.抗原在分子量上有一定的要求,所以一般将类似物作为半抗原接到适当载体上构成抗原。
1975年,Kohler和Milstein 发明了具有历史意义的单克隆技术,使抗体酶的获得成为可能。
1986年,美国Scripps Clinic研究所的R.A.Lerner等宣布研制成功首例对羧酸酯水解具有催化活力的抗体酶。
同年,加州大学的P.Schultz等宣布单克隆的MOPC167抗体可以催化对硝基苯氧基羧基胆碱的水解。
抗体技术的发展经历了三个阶段,一是通过免疫动物产生血清多克隆抗体;二是细胞工程阶段,即用杂交瘤技术产生单克隆抗体;三是利用基因工程途径表达和改造抗体。
2.抗体酶的催化作用机理抗体酶是生物体受抗原诱导产生的具有催化能力的抗体,其在结构上与抗原高度互补并能与之特异结合。
通过设计化学反应过渡态或中间体类似物作为半抗原,诱导机体产生抗体,产生的抗体能特异性地识别过渡态分子,降低反应的活化能,达到催化反应的目的。
抗体酶和所有的抗体一样,都是由两条轻链和两条重链构成,抗原与轻链和重链的可变区特异性结合,因此可变区的氨基酸的排列顺序决定了抗体分子的特异性,其本质是一类具有催化活性的免疫球蛋白,可变区赋予其酶的属性,所以也称为催化抗体。
单一模拟物(半抗原)诱导产生的多种催化抗体,其轻重链可变区具有高度同源性,氨基酸序列的不同表现为亲和力高低及催化能力大小的差异。
按照酶的过渡态学说,抗体酶可能是通过可变区与过渡态结合并使之稳定,提供易化旁路,从而加速反应的进行,有人认为轻链主要介导催化活性,而重链主要起结合作用和调节动能,其中影响活性的区域主要是CDR3区。
抗体与酶都是蛋白质,且都能高度选择性地与靶分子结合,但酶的种类仅有几千种,而抗体的种类可达千万种以上。
抗体酶的发现打破了只有天然酶才有分子识别和加速催化反应的传统观念,为酶工程学开创了新的领域。
抗体酶可催化趋向性反应及非趋向性反应,后者可能分为两种情况:一是在放热分解反应中控制反应构象,使多产物反应转变为单产物生成为主的反应;另一种情况是降低反应中过渡态能障。
但抗体酶缺少天然酶的韧性或扭曲性,没有天然酶所具有的底物去稳作用,而可能只起稳定过渡态的作用[4]。
不同方法制备的抗体酶作用机理不尽相同。
如化学突变法制备的抗体酶直接作用于底物;有的抗体酶与天然的蛋白水解酶类似,具有相似的活性催化位点。
目前抗体酶催化的反应类型比较广泛,除目前研究较多的酯水解反应外,还可以催化一些交换合成等反应。
3.抗体酶的制备方法目前抗体酶的制备方法主要有杂交瘤技术,抗体结合部位修饰法,克隆免疫反应因子的基因等多种方法。
3.1杂交瘤技术经体内免疫后再进行细胞融合是制备抗体酶的一种传统方法。
杂交瘤技术的基本原理是用不能在培养液中生长的但能产生抗体的脾脏细胞,与能在培养液中生长的骨髓瘤细胞进行融合,融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养,通过选择培养,以获取能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
再把这些细胞单克隆化,即繁殖成母体的同一细胞或形成菌落。
这些菌落能够产生单一均匀的抗体,可用于进行单克隆抗体的扩大生产。
对这些菌落用酶联免疫吸附法(ELISA)等方法加以筛选。
该制备方法的关键是要有合适而稳定的过渡态模拟物作半抗原,以产生与过渡态高度亲和的抗体酶。
由于大多数反应过渡态类似物的分子量较低,即所谓的半抗原,他们本身免疫原性很弱,必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。
本方法所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于化学模型物的设计,现在应用的设计策略包括:诱导和转化设计,反应免疫,“潜过渡态”半抗原设计等等[5]。
3.2抗体结合部位修饰法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位,一般可采用两种方法:即选择性化学修饰法和基因工程定点突变法。
抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。
对抗体酶进行结构修饰的关键,是找到一种吻合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基团或辅助基团,如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确空间排布恰到好处,就能产生高活力的抗体酶。
为提高抗体酶的催化能力,可采用邻近效应,静电催化,应变,功能团催化等方法,在抗体结合位点引入催化基团。
基因工程定点突变法是利用位点专一性突变引起抗体结合部位氨基酸的改变,能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基酸,进而改变抗体酶的催化效率。
目前,定点突变的方法己成为提高抗体酶活性的一种常规方法。
3.3克隆免疫反应因子的基因通过PCR技术克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因,建立单独产生重链和轻链的噬菌体文库,然后再通过每个载体中存在的非对称限制位点使它们随机地将基因的轻重链结合,这些含有上百万个高水平表达的轻链和重链片段的文库在大肠杆菌中表达和组装,就可大量制造Fab片断了。
这样的文库在保留亲本单克隆的识别和亲和特性的基础上利用了免疫因子的多样性,通过这种方法我们可从上百万种可能性中选择抗体酶。
4.抗体酶的设计4.1诱导法这是抗体酶的传统制备方法。
选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物,与载体蛋白偶联后免疫动物,使宿主产生抗体,再利用杂交瘤技术来筛选和分离,得到具有催化活性的单克隆抗体就是抗体酶。
用单克隆化的杂交瘤细胞就能进行单克隆抗体的扩大生产。
由于多数反应过渡态类似物的分子量较低,即半抗原本身的免疫原性很弱,必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。
目前最常见的载体蛋白包括牛血清蛋白(bovineseurmalbomni,BSA)和钥孔血蓝蛋白(keyholelilnpethemoeynain,KLH)[6],所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于反应过渡态类似物,即半抗原的设计。
要求通过半抗原的设计,产生最优化的抗体催化剂,实现与免疫球蛋白结合口袋的互补[7]。
现已应用的设计策略包括:过渡态类似物设计、诱导和转换设计、反应免疫、“潜过渡态”半抗原设计等[8]。
4.2工程抗体催化法工程抗体催化法借助基因工程和蛋白质工程技术,对抗体进行改造,引入催化性,将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上,也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列,以获得高效的抗体酶[9]。
目前,定点突变的方法已成为提高抗体酶活性的一种常规方法。
此外,对抗体结合口袋中的氨基酸残基进行随机突变,再用合适的体外筛选方法,就可获得高活性的抗体。
随着噬菌体抗体库技术的完善,可根据需要构建适当序列的基因片断,绕过免疫学方法,构建全新的抗体酶。
在此基础上,人们又发展了噬菌体展示技术[10],这种技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达,与高效快速的筛选手段结合起来,彻底改变了抗体酶生产的传统途径,用工程抗体催化法生产抗体酶,不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞,并且可筛选具有特定功能的未知结构,具有生产简单、价格低、抗体的免疫原性较低的优点,并易获得稀有的抗体。
4.3拷贝法用已知的酶作为抗原免疫动物,通过单克隆技术,制得该种酶的抗体。
以此种抗体免疫动物,再次采用单克隆技术,经筛选与纯化,就可获得具有原来酶活性的催化抗体[11]。
因为抗原和由其诱导产生的抗体具有互补性,经过二次拷贝后,就把原来酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上,使该抗体酶具有高选择性地催化原酶所催化的反应的能力。
4.4化学修饰法对抗体进行化学修饰,引入酶的催化基团或辅助基团,如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处,就能产生高活力抗体酶。
为提高抗体酶的催化能力,可采用邻近效应、静电催化、应变、功能团催化等法,在抗体结合位点引入催化基团[12]。
对抗体酶进行结构修饰的关键,是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。
5.抗体酶的应用5.1在医学领域的应用随着对抗体酶研究的深入进行,抗体酶越来越显示出其在医学领域中的潜在应用价值。