高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率
中药药效物质基础的研究究现状与展望
中药药效物质基础的研究究现状与展望宋霁翔，褚福浩，王鹏龙，徐昕，李国梁，周粲，汤明杰，李强，雷海民+(北京中医药大学中药学院，北京100102)摘要：中药是中医药体系的重要组成部分，在临床治疗中广泛应用，中药药效物质基础研究对深层诠释中医药科学内涵及中医药理论的现代创新具有十分重要的作用，本文就近几年该领域的研究进展及方法进行综述，旨在为读者提供有益的肩示。
关键词：中药；物质纂础；理论；途径Situation and Prospect of Research on Potential Basis ofC hinese MedicineS O N G Ji—x ia ng，C HU Fu—hao，WANG Peng-10ng，XU Xin，L I GuO—liaIlg，ZHOU-Shen，TANGMing-jie，LI Qiang，LEI Hai-min木(Sc ho ol of ClI in e se Ph锄a吼BeijiIlg UniVerS时of Chin眦Medici北，Beijing 100102，Chim)Abs tr act：TCM is an impOn an t co m p on e n t oftlle Sys tem of Ch in es e m e di c in e，an d widel y use d in clinic altr e at m en t，T0 study the pote嘶al b弱is of Ch ine se medici舱is v e r y irnport锄t fo r eval岫ting Chinese medici地s onmod锄ization o f ChiIle辩瑚teria m e d ic a．i n this p a p e L the re s ea fc ha scjent i最c b黔is a nd p rom oti ng d lep ro g r es sa11d the m e tI l o d s in this field in fecent yea rs w e r e reviewed to propose n e w iIlsights柚d印proaches fbr the丘Itu∞developm髓t．Ke)啪rds：Tmditional Chinese m e di c in e：po t en t ia l b私is；111eo哆；P atll wa、，中药是在中医理论指导下用以防病治病的天然物质，有上千年的应用历史。
中药活性成分与血清白蛋白结合的研究
中药活性成分与血清白蛋白结合的研究急诊急救论文急救护理论文医学护理论文医学核心期刊1 仪器与材料1.1 仪器F-4500型分子荧光分光光度计（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC 型紫外-可见光分光光度计（北京普析公司）；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋涡混合器，精密天平（Germany,Sartorius），pHS-3酸度计。
J-810圆二色分光光度计（Japan，Jasco）；彩陆毛细管电泳系统（北京，中科院化学所），配紫外检测器和HW-001色谱工作站（中国，千谱软件有限公司）；未涂层石英毛细管，52 cm ×50 μm i.d.，有效长度为44 cm（中国河北永年光学纤维公司）；超滤管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO., LTD, USA）；TGL－16型高速台式离心机（湘仪）。
1.2 试剂牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的储备溶液，4 ℃保存备用；18β－甘草次酸（GA，≥97%,Fluka, product of Spain）；槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素对照品，购自中国药品与生物制品检定所（中国北京）；甲基莲心碱（由中南大学湘雅医院药剂科刘韶惠赠，HPLC纯度大于98％）；中药活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化钠二水磷酸二氢钠（河南焦作），盐酸（湖南师范大学化学试剂厂）。
除已标明者外，试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。
2 方法2.1 光谱实验方法2.1.1 荧光猝灭方法在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液、2 ml BSA储备溶液，以水定容为10 ml, 摇匀，在一定温度下静置30 min。
高效液相色谱法在中药制剂有效成分含量测定中的应用
北方药学2016年第13卷第2期高效液相色谱法在中药制剂有效成分含量测定中的应用陈华（鄂尔多斯市中心医院鄂尔多斯017000）摘要：中药所含成分多样复杂，为质量标准的研究带来挑战。
高效液相色谱法以其高效准确、灵敏、应用范围广等特点，在中药含量测定中发挥着重大作用。
本文对高效液相色谱法在中药制剂有效成分含量测定中的应用展开介绍，其中包括生物碱类、中药苷类、黄酮类、萜类成分含量测定。
关键词：高效液相色谱法中药制剂有效成分含量测定中图分类号：R927.1 文献标识码：A 文章编号：1672-8351（2016）02-0019-01近年来，高效液相色谱法（HPLC）在多种结构类型的中药活性成分含量测定中的应用较为广泛。
这是由于HPLC与其他分离分析方法相比，具有灵敏度高、柱效高、分离速度快、重现性好、用范围广、操作方便等优点。
因此，HPLC成为中药制剂有效成分质量控制的重要手段。
以下对其在生物碱类、中药苷类、黄酮类、萜类有效成分含量测定中的应用进行介绍。
1生物碱类成分含量测定生物碱在中药界分布较广、种类较多、化学结构复杂，大多数生物碱化合物具有药理活性，成为中药的有效成分之一。
目前，临床中的生物碱成分大约80多种，由于生物碱存在形式不同（游离型与成盐型），碱性强弱不同。
采用HPLC法能够准确测定生物碱的有效成分含量。
侯伟雄等[1]利用HPLC法测定苦参碱分散片中苦参碱的含量，得出的结论是HPLC测定苦参碱含量准确、操作简便、结果可靠、方法可行。
朱丹妮等[2]采用蒸发光散射检测器和Shimadzu-10A高效液相色谱仪，对贝母类药材中生物碱成分进行了测定，结果表明，贝母类生物碱HPLC-ELSD 图谱有明显差异，样品制备简便，分离度较好，重现性佳，可用于贝母类药材的质量控制。
2中药苷类成分的含量测定苷类在中药界分布广泛，生理活性多种多样，如芍药苷、苯甲酰芍药苷类具有抗氧化、抗炎、抗肝损害、调节免疫等作用。
超滤法结合高效液相色谱法测定淫羊藿苷的血浆蛋白结合率
・
５ ・ ８
Ｃｈｉ ｅｓ Ｊ ｕ ｎ ｏｆ ｎ ｏｒ ａｔｉ ｎ ｎ Ｃ ｎ ｅ ｏ ｒ ａ１ Ｉ ｆ ｍ ｏ ｏ Ｔ Ｍ
Ｆ ｂ ０１ Ｖ ． Ｎ ．２ ｅ ．２ Ｏ１ １９ ｏ ２
超滤法 结合高效液相色谱法测 定淫羊藿苷 的血浆蛋 白结合率
李 向军 ， 王海 荣， 刘敏 彦 ， 军永， 安 王超， 王胜
Ｌ ａ ｇ ｕ ，ＷＡＮ Ｈ ｉ ｏｇ Ｉ ｎｙｎ Ｎ Ｊ ｎｙ ｎ ，ＷＡＮ Ｃ ａ ，ＷＡＮ Ｓ ｅｇ （ｈ ｉ ｈ ａ ｇ ｉｎ Ｉ Ｘｉ － ｎ ｎｊ Ｇ ａ— ｎ ，Ｌ Ｕ Ｍｉ—ａ ，Ａ ｕ —ｏｇ ｒ Ｇ ｈｏ Ｇ ｈ ｎ Ｓ ｉａ ｕｎ Ｙ ｉｇ ｊｚ ｌ
Ｐ ａｍ ｃｕｉ ｌ ｏ Ｌｄ， ｈ ａｈ ａ ｇ ５ ０ ５ Ｃ ｉ ｊ ｈ ｒ ａ ｅ ｔａ ． ｔ．Ｓ ｉ ｚ ｕｎ ０ ３ ， ｈｎ ｃ Ｃ ， ｉ ｆ ０ ａ
Ｍ ｅｈ ｄ ｔ ａ ｌｒ ｉ ｎ ｅ ｈｏ ｏ ｌ ｄ ｗ ｉｈ ｔ ｏ ｓＵｌｒ ｆ ｔａｔｏ ｍ ｔ ｄ ｃ ｕｐ ｅ ｔ ＨＰＬＣ ｒ ｍ ｐｌｙｅ ｏ ｄ ｔ ｒ ｉ ｏ ｅｎ ｎｄ ｎｇ ｒ ｅ ｉ ｗｅ ｅ ｅ ｏ ｄ ｔ ｅ ｅ ｍ ｎｅｐｒ ｔ ｉ ｂｉ ｉ ａｔ ｓ
型离心超滤 管 （ｉ ｉｏ ｅ ０ Ｄ ０ ５ ｍ ， ；Ｍ 一 Ｍ ｎ ｐ ｒ ，１Ｋ ， ． Ｌ ） Ｍ ２型快速旋 涡 振 荡器 （ 江苏省姜堰市沈高康健生化器具厂） Ｔ ６ ３型高速 ；Ｇ １— 离心机 （ 北京时代 北利 离心机有 限公 司） 。 ２ 方法与结果
高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率
，摇， 合后 混 ＼ ＼ ＼ 振
ＮＨ
０２ ． ５ｍＬ浓 度 为 １ ５ ｔ ｌＬ的 葛 根 素 溶 液 混 合 并 ． ｍｏ／ ｘ Ｈ Ａ 及 葛 根 素 的 浓 度 分 别 为 ６０ Ｓ ３ ｐ ｌＬ和 ０ ７ ｘ ＵＬ， 中 ＨＳ 的 浓 度 与 人 血 ￣ ／ ｍｏ ．５ｔ ｍｏ 其 Ａ
器 ； ｌ — 纯 水 系 统 （ ｌｐ ｒ ，ＵＳ Ｍｉ ｉＱ ｌ Ｍｉｉ ｏ ｅ ｌ Ａ）；Ｔ ｅ ｍｏ ｈｒ
３ ｍｉ ０ ． ⑩ ｎ后 移 取 至 规 格 为 １ ５ｍＬ 的 超 滤 装 置 中 离 心 ３ ｎ １ ０ ／ ｎ） 超 滤 膜 截 留 相 对 分 子 质 量 ０ｍｉ（ ００ ０ｒ ｍｉ ， ⑩ （ Ｌ 分 析测 定 。 ＨＰ Ｃ） 为 了 消 除 超 滤 膜 对 药 物 的 吸 附 对 测 定 结 果 的 干
蛋 白的结 合 率影 响着药 物在 体 内的药 动学 及药 效学 结果 ， 定药 物一 白结合 率对 临床 用 药具 有 重要 意 测 蛋
义 。 由此 可 见 ， 中 药 的 现 代 化 过 程 中 ， 究 中 在 研 药 有 效 成 分 与 血 清 白 蛋 白 问 的 相 互 作 用 ， 于 提 高 对 中药 用 药 的 科 学 性 ， 解 中 药 药 物 分 子 在 体 内 的 转 了 运 和 代 谢 等 具 有 特 别 重 要 的 意 义 文 献 ［ ］ 用 ４ 采
。
ｏ
１ ４ 超 滤 实 验 ．
Ｇｏｔｎ ｉ ｉ ｒ
ｎ
Ｐ ｅａ ｎ ｕ ｒｄ
取 ２ Ａ 于 ０ ２ ０ ｍｇ ＨＳ ． ５ ｍＬ 磷 酸 缓 冲 液 中 ， 与
Ｄ
图 １ （ ） 根 素 与 （ ） 依 春 的 结 构 ａ葛 ｂ告
蛋白质结合率的测定方法
1.平衡透析法：
优点：简单、经济、受实验因素干扰小等 缺点： 1)透析平衡时间较长。 2)血浆和缓冲液的pH值以及离子强度必 须严格控制。 3)受稀释作用、Gibbs—Donn舳效应以 及体积迁移效应的影响。 4)非特异性的透析设备表面的药物吸附 效应。
2.超滤法：
超滤法利用半透膜原理。为 解决超滤过程中非特异性超滤装 置表面的药物吸附问题．在测定 皮质激素与血浆蛋白结合的过程 中。Taylor等51对传统超滤法进 行了改进，解决了可溶性差以及 药物的吸附问题，使方法特别适 合于先导化合物的优化。
总之，测定药物血浆蛋白结合率的方法还有 很多，如超速离心法，该法对药物的吸收较 少，主要受药物沉积作用的影响；凝胶过滤 法，该法省时快速，可适用于高分子量的药 物；此外，色谱法，质谱法，圆二色谱法以 及多种检测方法联用技术在测定血浆蛋白结 合研究中有很广阔的发展前景。近年来，随 着高通量药代筛选技术的迅猛发展，这种高 效、高速的新技术也应用到血浆蛋白结合率 的测定研究中。
5.高效前沿分析法(HPFA)：
优点：1)样品预处理简单，允许直接进样，可以连接到 在线的高效液相色谱或毛细管电泳系统中进行自动分 析。2)所采用的流动相是模拟人体生理环境的磷酸盐缓 冲液，属于水性介质。3)当药物峰与蛋白峰完全分离时， 可同时从药物平台峰的峰面积和峰高计算出总药物浓 度和游离药物浓度。4)串联一个手性高效液相色谱法 (HPLc)柱，或与毛细管电泳手性拆分技术相结合，可分 别得到外消旋体中两个对映体的平台峰，求得蛋白结 合参数。5)具有调节效应相当于药物的富集，大大提高 了样品的检测限，可用于药物蛋白结合率很高、游离 药物浓度极低的药物研究。6)可以分析纳摩尔级的样品， 或进行纳升量样品的测定。HPFA对于分析药物与缺乏 的或较难获得的蛋白质的结合研究是非常有利的。
用高效液相色谱法测定人血浆中黄芩苷与血浆蛋白的结合率
用高效液相色谱法测定人血浆中黄芩苷与血浆蛋白的结合率王弘;陈济民;张清民
【期刊名称】《沈阳药科大学学报》
【年(卷),期】2000(17)2
【摘要】用高效液相色谱法对人血浆中黄芩苷进行了测定 .在 5、15、2 5 μg/mL 范围的回收率为95 .0 %、88.7%、94.2 % .人血浆中黄芩苷与血浆蛋白的结合率测定 ,为设计合理的给药方案提供了实验依据 .
【总页数】3页(P107-109)
【关键词】黄苓苷;蛋白;结合率;血药浓度;HPLC
【作者】王弘;陈济民;张清民
【作者单位】沈阳药科大学药学系
【正文语种】中文
【中图分类】R969.1
【相关文献】
1.超滤法结合高效液相色谱法测定淫羊藿苷的血浆蛋白结合率 [J], 李向军;王海荣;刘敏彦;安军永;王超;王胜
2.中空纤维液相微萃取结合高效液相色谱法测定比索洛尔血浆蛋白结合率 [J], 刘亚非;马海英;宫雪菲;王宝华
3.高效液相色谱法测定金银花中黄酮类成分槲皮素的血浆蛋白结合率 [J], 修玮
4.高效液相色谱法研究蓝萼甲素与大鼠血浆蛋白的结合率 [J], 曹露晔;陈子君;李云森;李仪奎
5.高效液相色谱法测定大鼠血浆中马钱子碱与血浆蛋白的结合率 [J], 徐金华;陈军;蔡宝昌;高颖
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱与串联质谱法测定游离丙戊酸钠与人血浆蛋白的结合率
空 纤 维前 处理技 术 结合 高效 液相 与 串联 质谱 法 ，测 定游 离丙戊 酸钠 的 浓度 ，采 用蛋 白沉 淀 法测定人 血 浆
中总的 丙戊酸 钠 的 浓度 。结 果 ：低 、 中 、高 ３ 种 浓度 下 ，丙 戊酸钠 的血 浆蛋 白结合 率分 别 为 ８ ８ ． ２ ７ ％、 ８ ９ ． ６ ３ ％、９ ５ ． ５ ５ ％。 结论 ：建 立 的方 法 经方 法 学考 察 能满足 药品分 析要 求。
ＬＣ－ ＭＳ ／ ＭＳ Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｆｒ ｅ ｅ Ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ Ｖａ ｌ ｐｒ ｏ ａ ｔ ｅ Ｃｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｂｉ ｎｄｉ ｎｇ Ｒａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｓｏ ｄｉ ｕｍ Ｖａ ｌ ｐｒ ｏ ａ ｔ ｅ ｔ ｏ Ｈｕ ｍａ ｎ Ｐｌ ａ ｓ ｍａ Ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎｓ
对样 品进行前 处 理 ，不仅 能准 确测 定游 离丙 戊酸 的 浓 度 ，还 大 大 降 低 了损 失 。 本 文建 立 了丙 戊 酸 钠 在人 血 浆 中游离 和 总浓度 的测 定方 法 ，考察 丙戊 酸 钠 的血浆 蛋 白结 合率 ，为 临床 上丙 戊酸 钠 的血药 浓 度监 测 和应 用提 供 了方法 和依 据 。
ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｖ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ａ ｔ ｅ ａ ｔ ｌ ｏ ｗ， ｍｉ ｄ ｄ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ ｈ ｉ ｇ ｈ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ８ ８ ． ２ ７ ％ ，８ ９ ． ６ ３ ％ ａ ｎ ｄ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2011年4月Vo.l 29No .4April 2011Chi n ese Journal of Chromatography358~361研究论文DOI :10.3724/SP .J .1123.2011.00358*通讯联系人:张秀莉,副研究员,主要研究天然小分子和多肽的分离分析.Te :l (0411)84379521,E m ai:l zhangx i uli @dicp .ac .cn .基金项目:重大新药创制专项(N o .2009ZX 09313 003)和国家自然科学基金面上项目(No .30801513).收稿日期:2010 12 08高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率蔡晓明1, 张 岩2, 于 龙1, 郭志谋1, 张秀莉1*, 梁鑫淼1(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析重点实验室,辽宁大连116023;2.Un ivers ity of C alifon ia Irvi ne ,CA 92697 4625,USA )摘要:采用高效亲和色谱技术(HPAC )对中药成分与人血清白蛋白(HSA )的相互作用进行了研究。
首先采用点击化学的方法制备了表面键合有HSA 蛋白的硅胶固定相并装填成亲和色谱柱,根据药物在该色谱柱上与空白硅胶柱上的保留时间差计算得到药物与蛋白的结合率。
利用该方法测得模型化合物华法令与H SA 的结合率与文献中采用超滤法测得的结果基本一致,表明该方法可用于测定药物与HSA 的结合率。
在此基础上用该方法测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA 的相对结合率分别为10 26%和10 20%。
同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率为14 25%。
结果表明,HPAC 可以作为研究药物与蛋白相互作用的一种简便可行的方法,其测定结果与超滤方法一致。
关键词:高效亲和色谱法;人血清白蛋白;葛根素;告依春;结合率;超滤中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2011)04 0358 04Detection of drug hu m an seru m albu m in b ind i ng ratios of t woCh i nese m edici nal ingred ients by h igh perfor m anceaffinity chro matographyCAI Xiao m i n g 1,Z HANG Yan 2,YU Long 1,GUO Zhi m ou 1,ZHANG X iuli 1*,LI ANG X in m iao1(1.CAS K ey L abora tory of Sepa ra tion Sc ien ce for An a ly tica l Che m istry ,D a lian In stitu te o fChe m ica l Phy sics,Chin ese Acade m y o f Scie n ces,Da lian 116023,Ch i n a;2.Un iver sity o f Ca lifon ia Ir vin e,CA 92697 4625,U SA )A bstract :The i n teraction of t wo Chinese m edici n al i n gredi e nts and hum an seru m al b u m in (HSA )has been investigat ed by high perf or m ance affi n it y chro m atography (HPAC ).HSA bounded silica based stati o nary phase w as prepared based on t he click chem istry strategy ,and packed in a colu m n (nam ed as HSA col u m n).The drug HSA binding rati o was calculated fro m t he diff erence of t he drug s ret enti o n ti m es on the H SA colu m n and silica col u m n (blank col u m n).T he warfari n HSA bindi n g rati o det er m ined by t his m ethod was s i m ilar to t he refer ence reported value by ultrafiltration m et hod .The results i n dicat ed that the new HSA colu m n and t he HPAC m et hod can be used for t he detection of binding ratio of drug and HSA .T he bi n di n g ratios of puerari n and goitri n deter m i n ed by the HPAC m ethod were 10 26%and 10 20%,respecti v e l y .And the binding rati o of puerarin deter m i n ed by ultrafiltrati o n was 14 25%.A ll t hese results showed t hat HPAC is a usef ul m et hod t o i n vestigate the interacti o n bet ween drugs and protein .K ey words :high perf or m ance affinity chro m atography (HPAC);hu m an seru m albu m i n ;puer ari n ;goitrin ;binding ratio ;ultrafiltration 人血清白蛋白(hu m an seru m albu m in ,HSA)是由585个氨基酸残基组成的一条单肽链,相对分子质量约为66500,是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白[1]。
H SA 上有多个药物结合位点,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被输送到身体的各个部位产生药效。
药物进入体内后的许多重第4期蔡晓明,等:高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率要的药动学参数(包括药物的代谢、排泄、分布、扩散等)都与药物和蛋白的结合率有关,因此药物与蛋白的结合率影响着药物在体内的药动学及药效学结果,测定药物 蛋白结合率对临床用药具有重要意义[2]。
由此可见,在中药的现代化过程中,研究中药有效成分与血清白蛋白间的相互作用,对于提高中药用药的科学性,了解中药药物分子在体内的转运和代谢等具有特别重要的意义[3]。
文献[4]采用高效亲和色谱法(hi g h perfor m ance affi n it y chro m atography ,HPAC)测定了丹皮酚与固定化人血清白蛋白的结合域。
葛根素[5](图1a)和告依春[6](图1b)分别是中药葛根和板蓝根中的主要成分,本文利用HPAC 方法,以HSA 为为固定相,测定了葛根素与告依春两种中药成分与H SA 的结合率,同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率,并将两种方法测得的值进行比较。
图1 (a)葛根素与(b)告依春的结构Fig .1 Stru ct ures of (a)puerarin and (b)goitrin1 实验部分1.1 仪器与试剂HP 1100高效液相色谱仪(美国Ag ilent 公司),包括G 1310A 四元梯度泵、G 1314A 二极管阵列检测器;M illi Q 纯水系统(M illi p ore ,USA);Ther m o868系列pH 计(美国热电集团)。
色谱数据通过HP 工作站采集和获得。
人血清白蛋白购自Sig m a 公司;葛根素购自西安山川生物技术公司;告依春为本实验室从板蓝根中经工业色谱分离纯化得到;华法令购自武汉远程科技发展有限公司;磷酸氢二钠与磷酸二氢钠购自北京精求化工厂,分析纯;水为超纯水。
1.2 溶液配制磷酸缓冲液:按7 3的比例称取Na 2HPO 4 12H 2O 和N a H 2PO 4 2H 2O 用超纯水配成0 067m ol/L 的缓冲液,并用N aOH 调节pH 至7 4。
HSA 模型化合物溶液:取华法令适量用磷酸缓冲液配制成10 m ol/L 的溶液。
样品溶液:取葛根素和告依春适量用磷酸缓冲液分别配制成3 m ol/L 和5m ol/L 的溶液。
所配制的溶液均于4 保存。
1.3 色谱条件所采用的HSA 色谱柱及空白柱(4 6mm 150mm )为本实验室采用click chem istry [7]方法制备得到,H SA 色谱柱的制备过程见图2,空白柱为未键合H SA 的叠氮硅胶柱。
流动相为0 067m ol/L 的磷酸缓冲液(pH 7 4),过0 45 m 膜。
葛根素和告依春分析时采用0 6mL /m i n 的流速,华法令分析时采用1 5m L /m in 的流速。
柱温为37 。
进样量为5 L 。
葛根素的检测波长为254n m,告依春为280n m,华法令为308n m 。
图2 HSA 亲和色谱柱的制备Fig .2 P reparation strategy of t he H SA st ati onary phase1.4 超滤实验取20m g H SA 于0 25mL 磷酸缓冲液中,与0 25mL 浓度为1 5 m ol/L 的葛根素溶液混合并振摇,混合后HSA 及葛根素的浓度分别为630 m ol/L 和0 75 m ol/L ,其中HSA 的浓度与人血清中的白蛋白浓度一致。
将混合溶液在37 孵育30m i n 后移取至规格为1 5m L 的超滤装置中离心30m i n (10000r/m in),超滤膜截留相对分子质量为3kD a 。
滤液中葛根素的含量经高效液相色谱(HPLC)分析测定。
为了消除超滤膜对药物的吸附对测定结果的干扰,取0 5mL 浓度为0 75 m ol/L 的葛根素溶液直接在37 孵育30m i n 后移取至超滤装置中离心30m i n (10000r/m i n ),滤液用HPLC 分析。