实时荧光PCR检测Nam Dinh病毒方法的建立及初步应用

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实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。

自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。

随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。

本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。

文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。

接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。

文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。

通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。

二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。

其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。

实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。

定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。

PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。

实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。

反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。

2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。

PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。

循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。

3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。

4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。

5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。

比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。

实时qPCR具有广泛的应用。

1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。

2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。

3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。

4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。

实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用

实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于精确测量目标DNA或RNA的数量。

该技术在许多领域得到了广泛的应用，如医学诊断、基因表达分析、病原体检测以及环境监测等。

一、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术基于PCR反应过程中，目标DNA（或RNA）序列的指数级扩增特性。

该方法需要引物与目标序列相互结合，合成适量的荧光探针用于监测PCR过程中目标序列的扩增程度。

其中，引物是起始特异性扩增的核酸片段，荧光探针含有荧光染料和荧光阻断剂。

当探针结合至目标序列时，就会被5'→3'外切酶降解，并释放荧光信号，实时监测PCR反应进程。

二、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度和高精确度：实时荧光定量PCR技术通过荧光信号的动态监测，可准确测量目标序列的扩增数量。

其灵敏度能够达到单个拷贝级别，且可靠性高，消除了传统PCR中间断性的'瓶颈'效应。

2. 快速和高通量：相比传统PCR技术，实时荧光定量PCR所需的时间更短，反应速度快。

通过多重PCR反应孔，可以同时测定多个样品，提高了检测效率。

3. 广泛的应用范围：实时荧光定量PCR技术不仅适用于基因表达、基因突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，还可用于病原体的检测和定量，如病毒感染、细菌感染等。

4. 可靠的检测结果验证：通过内参基因和集成阳性对照，可以消除检测结果偏差，确保检测结果的准确性和可靠性。

三、实时荧光定量PCR技术的应用1. 医学诊断：实时荧光定量PCR技术在临床医学诊断中具有很大的潜力，可用于早期肿瘤标志物、病原体和遗传疾病的检测与定量。

例如，可通过检测突变基因来判断特定癌症患者对某些药物的敏感性，从而为精准化治疗提供依据。

实时荧光定量PCR技术原理与应用

实时荧光定量PCR技术原理与应用聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。

在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。

无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。

但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。

例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。

在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。

所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图( 如图 1，2) 。

图 1 实时荧光扩增曲线图图2 实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件

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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、提取核酸等处理，以获得待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设备测定核酸浓度和纯度，确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用引物设计软件进行引物设计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特异性好、扩增效率高的引物。

实时荧光PCR技术在病毒检测中的应用研究

实时荧光PCR技术在病毒检测中的应用研究病毒是一类能够侵入人体细胞并引起感染的微生物，其对人类健康的危害极大。

因此，研究和开发高效准确、快速可靠的病毒检测技术成为了当前医学领域的热点。

其中，实时荧光PCR技术正被越来越广泛地应用于病毒检测领域。

实时荧光PCR技术是一种通过特定的引物和探针检测DNA或RNA序列的方法，其最大的优势在于其高灵敏度和高特异性。

病毒在人体内存在的浓度较低且病毒的种类繁多，因此需要在样本中检测到极其微小的病毒数量且可以检测多种病毒。

实时荧光PCR技术正好满足这一要求，可以检测到极低浓度的病毒核酸，并且可以同时检测多种病毒。

在实时荧光PCR技术的运用过程中，需要使用特定的引物和探针，来与待检测的病毒核酸序列进行特异性结合，并在PCR扩增反应过程中发挥作用。

同时，针对不同的病毒品种，可以设计出不同的引物和探针，以保证检测的特异性。

在PCR反应过程中，引物和探针会特异性地与目标序列结合，产生一个带有荧光信号的DNA或RNA片段。

而荧光强度的大小，则可以反映出病毒的存在浓度以及扩增反应的情况。

实时荧光PCR技术的应用范围非常广泛。

其可以应用于多种病毒的检测，包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）等。

同时，实时荧光PCR技术也可以用于快速检测流行性感冒作者发表的文章（或猪流感）等新型冠状病毒，因此也被广泛应用于对全球传染病疫情的监测和预警。

总之，实时荧光PCR技术的高灵敏度、高特异性和多重检测能力，使其成为当前病毒检测方向的重要技术手段之一。

而未来随着实时荧光PCR技术及其应用领域的不断发展，其在病毒检测领域的应用前景也将更加广阔。

实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展

实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
一、实时荧光定量PCR技术原理及方法
实时荧光定量PCR技术是一种结合了PCR和荧光信号检测的新型分析技术。

其原理是通过引入一种荧光探针或染料，使PCR反应进行过程中产生的DNA片段或RNA片段能够发出荧光信号，从而实现对PCR产物的实时监测和定量分析。

在实时PCR过程中，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过测定荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。

实时荧光定量PCR技术的方法包括SYBR Green I法和探针法两种。

SYBR Green I法是利用SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光的特性，实现对PCR产物的定量分析。

探针法则是引入一种特定的探针分子，当探针与PCR产物结合时，荧光信号会产生变化，从而进行定量分析。

两种方法各有优缺点，研究者可根据具体实验需求选择合适的方法进行实时PCR分析。

实时荧光定量PCR技术在医学诊断中具有重要的应用价值。

它可以用于病原体检测，如病毒、细菌等的快速定量分析。

通过设计特异性的引物和探针，可以实现对病原体的快速检测和定量分析，为临床诊断提供重要的依据。

实时荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的检测，如常见的遗传病突变、肿瘤基因突变等。

通过对基因突变的定量分析，可以为临床诊断和治疗提供重要的信息。

实时荧光定量PCR技术还可以用于药物代谢酶基因的表达分析，从而指导个体化药物治疗。

实时荧光定量PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用前景，有望成为未来医学诊断的重要手段。

实时荧光定量PCR检测HULClncRNA方法的建立及初步应用

实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA方法的建立及初步应用汪先桃郭变琴梁勤东涂植光*(重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016)［摘要］目的：建立实时荧光定量PCR检测长链非编码RNA HULC的方法，探讨其在作为肝癌标志的应用价值。

方法：根据Genebank中的HULC lncRNA(AY914050.1)全序列, 设计HULC基因的特异引物, 构建HULC基因的T克隆载体，命名为pMD18-T-HULC；以pMD18-T-HULC为实时荧光定量PCR检测HULC的标准品，建立实时荧光定量PCR检测HULC的方法并进行方法学评价。

应用此方法检测8种肿瘤细胞株、肝癌组织、其它癌及癌旁组织中HULC lncRNA的表达。

结果：HULC实时荧光定量PCR检测方法学的最低检测限为1.8×103拷贝/L, 线性范围为1.8×103拷贝/L~4.6×109拷贝/L；该法的批内变异系数（CV）<2.0%, 批间CV<8.0%。

其在肝癌组织和肝癌细胞株起始表达量为(7.6±3.1)×105拷贝/L ~(5.6±3.2)×106拷贝/L，明显高于其它癌和癌旁组织HULC lncRNA表达量（<1.8×103拷贝/L）。

新发现膀胱癌细胞株T24中表达量高[(6.7±2.4)×105拷贝/L]，但在膀胱癌组织中表达低（<1.8×103拷贝/L）。

结论：成功建立了实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA 的方法，HULC lncRNA可望作为肝癌的标志。

［关键词］HULC；lncRNA；实时荧光定量PCR；肝癌[中图法分类号]R446.9; R34;R73-31［文献标志码］ＡEstablishment of the method of real-time fluorescence quantitative PCR detection of HULC lncRNA and its primary applicationWANG Xiantao, GUO Bianqin, LIANG Qindong, TU Zhiguang*(College of Laboratory Medicine, Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics, Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China) [Abstract] Objective To establish a real-time fluorescent quantitative PCR for method the detection of long non coding RNA HULC(highly up-regulated in liver cancer), and to explore its application value of hepatocellular carcinoma marker.Methods Specific primers for HULC lncRNA gene were designed according to full HULC lncRNA sequence in Genbank (AY914050.1). The T cloning vector for the quantitative standard of HULC gene detection was constructed and named pMD18-T-HULC. The real-time fluorescence quantitative PCR method of HULC was established and methodologically evaluated. The primary application of this method to detect HULC lncRNAin 8 types of tumor cell lines, and liver cancer and other cancer tissues was investigated. Results作者简介：汪先桃（1977年-），男，博士研究生，主要从事肿瘤诊断的研究* 通讯作者：涂植光（1946年-），男，教授，博士生导师，主要从事肿瘤微环境的研究电话:(23)-68485759,E-mail:tuzhiguang@The minimum detection limit of established HULC real-time fluorescent quantitative PCR detection method was 1.8×103 copies /L, the linear range was 1.8×103 copies /L ~4.6 ×109 copies /L, the intra-run coefficient of variation (CV) was < 2.0%, and the inter-run CV was < 8.0%. The starting expression levels of HULC lncRNA in hepatocellular carcinoma and hepatocarcinoma cell lines were (7.6±3.1)×105 copies/L ~ (5.6±3.2)×106copies/L, significantly higher than other cancer and paracancerous tissue (all <1.8 ×103copies /L). It was first found that HULC lncRNA was high expressed in human bladder cancer cell line T24 [(6.7±2.4)×105 copies/L], but was low expressed in bladder carcinoma tissues (<1.8 ×103copies /L). Conclusion: The real-time fluorescence quantitative PCR detection of HULC lncRNA is successfully developed, and HULC lncRNA may be a specific marker of hepatocarcinoma.[Key words] HULC; lncRNA; real-time fluorescence quantitative PCR; liver cancer Corresponding author: TU Zhi-guang, Tel:86-23-68485759, E-mail: tuzhiguang@ 肝癌在我国属于高发病，多数在乙肝肝硬化的基础上发展而来。

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Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄａｎｄｓｐｅｃｉｉｆｃｒｅａｌ — ｔｉｍｅｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒＮａｍＤｉｎｈｖｉｒｕｓ（ＮｄｉＶ）．
中图分类号：Ｒ３７３文献标志码：Ａ文章编号：１００３ — ４６９２（２０１５）０５ — ０４４７ — ０４
ＤＯＩ：１０．１１８５３６．ｉｓｓｎ．１００３．４６９２．２０１５．０５．００４
室分离的ＮＤｉＶ进行序列比对，找出保守序列（ＲｄＲｐ）并设计特异引物和ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ探针，通过调整引物、探针浓
度，优化其反应条件，对方法做灵敏度、特异性、稳定性实验，以评价反应体系。结果ＮＤｉＶ的ＴａｑＭａｎ — ＭＧＢ实时荧
实时荧光ＰＣＲ检测ＮａｍＤｉｎｈ病毒方法的建立及初步应用
梁克峰，刘渠，王德全，周健明，金玉娟２陈应坚，李静媚，甘莉萍２杨慧
１广东药学院，广州５１０３１０；２深圳市龙岗区疾病预防控制中心摘要：目的建立一种快速、特异检测ＮａｍＤｉｎｈ病毒（ＮＤｉＶ）的实时荧光ＰＣＲ方法。方法根据ＧｅｎＢａｎｋ和本实验
Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｉｎｉｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌ — ｔｉｍｅｌｕｏｆｒｅｓｃｅｎｔ
ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮａｍＤｉｎｈｖｉｒｕｓ
光ＰＣＲ检测方法用时短，灵敏度高，最低检测下限为０．１ＰＦＵ。与登革热１～４血清型病毒、流行性乙型脑炎、人呼吸道合胞病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒无交叉反应，特异性良好；将４份核酸含量不同的标准样品重复检测５次，平均０值变异系数范围为１．６７％￣３．６８％，稳定性较高。通过监测，龙岗区蚊虫携带ＮＤｉＶ概率为１８．００％。结论ＮＤｉＶ的ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光ＰＣＲ方法是一种快速、特异、灵敏、稳定性好的方法，可应用于流行病学环境监测，提高病毒的快速检测能力。关键词：ＮａｍＤｉｎｈ病毒；实时荧光定量ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ — ＭＧＢ探针；应用
１ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０３ｉ０，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ；
２ＬｏｎｇｇａｎｇＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｄＲｐ）ａｎｄｄｅｓｉｇｎｓｐｅｃｉｉｆｃｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＴａｑＭａｎ— ＭＧＢｐｒｏｂｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｐｒｏｂｅｗｅｒｅａｄｊｕｓｔｅｄｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＤｅ — ｑｕａｎ，Ｅｍａｉｌ：ｙｘｙｗｄｑ＠１６３．ｃｏｍ
ＳｕｐｐｏｓｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．２０１４Ａ０３０３１３５８３）
ＭｅｔｈｏｄｓＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＧｅｎＢａｎｋａｎｄＮＤｉＶｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｗｅｏｕｆｎｄｏｕｔｔｈｅ
中国媒介生物学及控制杂志２０１５年１０月第２６卷第５期
ＣｈｉｎＪＶｅｃｔｏｒＢｉｏｌ＆Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１５，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．５
・
・４４７・
பைடு நூலகம்
论
著・
ＬＩＡＮＧＫｅ — ｆｅｎｇ，ＬＩＵＱｕ，ＷＡＮＧＤｅ－ｑｕａｎ，ＺＨＯＵＪｉａｎ — ｍｉｎｇ２，ＪＩＮＹｕ－ｊｕａｎ，
ＣＨＥＮＹｉｎｇ－ｊｉａｎ，ＬＩＪｉｎｇ — ｍｅｉ，ＧＡＮＬｉ — ｐｉｎｇ，ＹＡＮＧＨｕｉ