基本转录元件结合蛋白2反义基因转染对血管平滑肌细胞表型转化的影响
基因沉默与RNAi技术
基因沉默与RNAi技术定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。
有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
基因沉默是一种RNA干扰技术。
RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。
其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核ＲＮＡ合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。
转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：１．基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。
［４］近来的研究表明，发生在转基因启动子５’端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。
NF-κB和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
山西农业科学 2023，51（11）：1252-1259Journal of Shanxi Agricultural SciencesNF-κB 和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用李君 1，王鹤洁 1，安洁 2，李俊玲 1，窦敏敏 1，翟竹汇 1，何浪 1，李振月 1，秦健 1，2，3，杜荣1（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；3.山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷 030801）摘要：成肌分化是动物肌肉发育的关键环节，与其健康和生产性能密切相关。
为研究成肌细胞抗氧化应激的机制，试验分离了绵羊胎儿成肌细胞，利用地塞米松处理分化中的成肌细胞建立氧化应激模型；试验分为4组，包括正常分化48 h 组（N 48 h ）、地塞米松处理分化48 h 组（Dex 48 h ）、正常分化72 h 组（N 72 h ）、地塞米松处理分化72 h 组（Dex 72 h ），通过倒置显微镜观察各组细胞的形态变化，利用ROS 检测试剂盒检测ROS 含量，用RNA -seq 检测NF -κB 和Nrf2信号通路相关基因mRNA 的表达情况，并采用皮尔森相关系数法分析相关性，用STRING 数据库分析蛋白的互作关系。
结果表明，地塞米松诱导的氧化应激对成肌分化具有明显的抑制作用，且抑制作用随处理时间的延长而增加；ROS 含量较各自对照组均显著增加，且随着处理时间的延长而增加。
由RNA -seq 分析结果可知，与对照组相比，地塞米松处理组NF -κB 和Nrf2信号通路被激活，上游基因P65、IKK2、IκBα、IκBβ、Nrf2、Keap1以及相应下游靶基因SOD1、SOD2、FHC 、HO -1、GSH -Px 的mRNA 相对表达量均显著升高，各基因之间存在不同程度的相关性以及错综复杂的蛋白互作关系，其中Keap1基因是联系2条通路的重要枢纽。
血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响
１．２．１大鼠血管内皮细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大 鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２－３厘 米，ＰＢＳ冲洗清除血细胞。翻转血管，结扎两端，注入ｌｇ／ Ｌ（Ｏ．１％）胶原酶于３７℃消化１５～２０ ｍｉｎ。收集消化液，１０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，沉淀用内皮细胞完全培养基重悬，接种于 六孔板（Ｃｏｍｉｎｇ，美国）中，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中常规 培养。血管内皮细胞完全培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
剥离培养孔底部悬浮于培养液中，镜下观察可见单层ＶＥＣｓ附 着在胶原凝胶底层。然后将ＶＳＭＣｓ细胞悬液按ｌ×１０４／孔密 度沿孔内侧壁轻轻加至浮胶底部，并放入３７＂（２，５％ＣＯｚ培养 箱，隔天换液一次。加入ＶＳＭＣｓ后整个操作过程避免晃动， 防止含有ＶＳＭＣｓ的细胞悬液进入浮胶上层。
１．２．４
１材料和方法
ＲＴ－ＰＣＲ椅测结果表明．４８ｈ共培养组ＶＳＭＣｓ的合成表型相关基因ＣＲＢＰ－ｌ、ｓｍ哪ｂ的表达水平显著高干单独培葬组．分别为Ｉ
４倍，ｌ ５
倍－７２ｈ选到峰值．分别为Ｉ ７倍、２Ｉ倍．９６ｈ开始下降，搀培养组中收缩表！标记物Ｓｍｏｏｔｈｅｌｆａ—Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的基园表达木平在４８ｈ、 ７２ｈ＆著低于单拙培养组．９６ｈ Ｓｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ却高于单独培养维。单抽培养组上进备ｇ因的变化趋势Ｔ变或保持稳定。免癌荧光结果显示 ＳＭ—ＭＨＣ＊白表达在共培养组中９６ｈ后从下降转为升高（Ｐ＜０ ０５）。结论在共培养体系中，血管内皮细胞对缸管平滑肌细胞表型转化的作 用表现为先促进向合成型转化，９６ｈ后促进向性缩型转化。 ！＊望ｉ加表型－细胞共培养一血管内皮细胞ｔ血管平滑肌细胞ｔ基目表达
ｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）与平滑肌细胞之间的相互作用是悯节
态和生理特性”。平滑肌细胞所表达的肌球蛋白莆链（ｓｍｉｔｈ
生物化学与分子生物学人卫版教材全集ppt课件
03
分子生物学基础
DNA、RNA和蛋白质的结构与功能
01
DNA双螺旋结构
DNA是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕而成的双螺
旋结构，碱基位于内侧，通过氢键相互配对，磷酸和脱氧糖在外侧构成
基本骨架。
02
RNA种类与结构
RNA是单链结构，根据功能不同分为mRNA、tRNA和rRNA。mRNA
是蛋白质合成的直接模板；tRNA具有携带氨基酸进入核糖体的功能；
rRNA是核糖体的主要成分，参与蛋白质合成。
03
蛋白质结构与功能
蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子，具有复杂的空间构
象和多样的生物学功能。
生物催化剂与代谢途径
总结词
介绍生物催化剂和代谢途径的基本概 念和作用。
详细描述
生物催化剂是指酶，具有高效性和专 一性，能够加速生物体内的代谢反应 。代谢途径是指一系列相互关联的生 化反应序列，是生物体内物质转化和 能量转化的基础。
生物氧化与能量转换
总结词
介绍生物氧化和能量转换的过程和作用。
详细描述
对人类社会的影响与意义
医领域
生物化学与分子生物学的发展将有助于疾病的早期诊断、 预防和治疗，提高人类的健康水平和生活质量。
工业领域
利用生物化学与分子生物学的原理和技术，开发新的工业 生产技术和工艺，降低能耗和环境污染，促进可持续发展 。
农业领域
通过分子生物学和基因工程技术的应用，培育出抗逆、抗 病、优质、高产的农作物新品种，提高农业生产效率和粮 食安全水平。
ERK信号通路的信号转导调控机制_赵明哲
第29卷第1期2009年2月国际病理科学与临床杂志 h t t p ://w w w .g j b l .n e tI n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f P a t h o l o g y a n d C l i n i c a l M e d i c i n e V o l .29 N o .1F e b . 2009收稿日期:2008-11-05 修回日期:2008-12-22作者简介:赵明哲,硕士研究生,主要从事磷酸化蛋白质组学和质谱技术的研究。
通讯作者:姜勇,E -m a i l :y j i a n g @f i m m u .c o m基金项目:国家自然科学基金(30670828,30670829,30572151);国家自然科学基金委员会-广东省人民政府自然科学联合基金(U 0632004)。
T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n (30670828,30670829,30572151)a n dJ o i n t F u n do f N S F Cw i t ht h e G u a n g d o n g P r o v i n c i a l G o v e r n m e n t (U 0632004).E R K 信号通路的信号转导调控机制赵明哲1,2,刘靖华2,李玉花1,姜勇2(1.东北林业大学生命科学学院发育生物学实验室,哈尔滨150040;2.南方医科大学广东省蛋白质组学重点实验室,广州510515)[摘要] 胞外信号调控激酶(E R K )是发现的第1个丝裂原活化蛋白激酶(M A P K ),它调控多种重要的细胞生物学过程,包括细胞增殖、分化和凋亡等。
华中农业大学生物化学本科试题库第18章基因工程基础
第18章基因工程基础单元自测题(一) 名词解释1.遗传工程2.生物技术3.基因工程4.细胞工程5.蛋白质工程6.分子克隆7.载体8.转化和转染 9.基因文库 10. cDNA文库(二) 填空1．自然界的常见基因转移方式有、、、。
2．不同DNA分子间发生的共价连接称为，有、两种方式。
3．基因工程的载体必须具备的条件有、、。
4．基因工程常用的载体DNA分子有、、和。
5．一个完整的DNA克隆过程应包括、、、、6．目的基因获取的途径或来源有、、、。
7．基因工程过程中重组体直接筛选法的方式有、、。
8．基因克隆真核生物表达体系常见的有、、表达体系。
9．根据重组体DNA的性质不同，将重组体DNA导入受体细胞的方式有、、等。
10．如果M13的外源基因被插入到lac Z基因内，则在含有X-gal的培养基上生长时会出现色菌落，如果在lac Z 基因内无外源基因插入，在同样的条件下呈现色菌落。
11．当细胞及细胞或细菌通过菌毛相互接触时，就可以从一个细胞(细菌)转移到另一细胞(细菌)，这种类型的DNA转移称为作用。
12．重组DNA技术中常用的工具酶有、、、。
(三) 选择题1．下列那种方式保证了免疫球蛋白的多样性?A. 转化B. 转染C. 转位D. 转导2．微切割技术使目的基因可来源于下列那种物质?A. 真核细胞染色体DNAB. 人工合成DNAC. cDNAD. G-文库3．重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是：A. 限制性核酸内切酶B. DNA连接酶C. DNA聚合酶ID. RNA聚合酶4．DNA致癌病毒感染宿主细胞后，使之发生癌变是因为发生了：A. 转化B. 转导C. 接合D. 转座5．关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的?A. 基因工程也称基因克隆B . 只有质粒DNA可作为载体C . 重组体DNA转化或转染宿主细胞D. 需获得目的基因6．有关质粒的叙述，下列哪项是错误的?A. pB R322含有β-半乳糖苷酶的α片段基因B. 质粒较易转化C. 质粒的遗传表型可作为转化子的筛选依据D. pB R322的分子中仅有一个E.co R I 内切酶位点7．下列哪项不是重组DNA的连接方式?A. 粘性末端及粘性末端的连接 B ．平端及平端的连接C . 粘性末端及平端的连接D . 人工接头连接8．有关噬菌体的叙述哪项不符合?A. 感染大肠杆菌时仅把D NA注入大肠杆菌内B. 只有裂解一种生活方式C . 溶源和裂解两种生活方式可以相互转变D. 噬菌体是由外壳蛋白和D NA组装而成9．D NA克隆不包括下列哪项步骤?A. 选择一个适合的载体B . 重组体用融合法导入细胞C . 用连接酶连接载体D NA和目的D NA，形成重组体D . 用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌10．下列哪项不能作为表达载体导人真核细胞的方法?A. 磷酸钙转染 B . 电穿孔 C . 脂质体转染 D . 氯化钙转染11. 下列哪项不能作为基因工程重组体的筛选方法?A. PC R技术B. 宿主菌的营养缺陷标志补救C . 抗药性标志选择 D. Southern印迹12．关于转化错误的是：A. 受体细胞获得新的遗传表型B. 外源D NA一定整合进受体细胞基因组C. 自然界中较大的外源D NA转化几率较低D. 自然界中较大的外源DNA转化几率较高13．下列哪种酶是重组DNA技术中最重要的?A. 反转录酶B. 碱性磷酸酶C. DNA连接酶D. DNA聚合酶I14．在分子生物学中，基因克隆主要指：A. DNA的复制B. DNA的转录C. DNA的剪切D. RNA的转录15．在分子生物学中，重组DNA又称为：A. 酶工程B. 蛋白质工程C. 细胞工程D. 基因工程16．cDNA是指：A. 在体外经反转录合成的及RNA互补的DNAB. 在体外经反转录合成的及DNA互补的DNAC . 在体外经反转录合成的及RNA互补的RNAD. 在体内经反转录合成的及RNA互补的RNA17．聚合酶链式反应常常缩写为：A. PRCB. PERC. PC RD. B C R18．在已知DNA序列的情况下，获取目的基因的最方便的方法是：A. 人工化学合成B. 基因组文库法C. cDNA文库法D. PCR法19．用于PC R反应的酶是：A. DNA连接酶B. TaqDNA聚合酶C. 逆转录酶D. 碱性磷酸酶20．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用A. 限制性内切核酸酶切除B. 用3′外切核酸酶切除C. 用S1核酸酶切除D. 用5′外切核酸酶切除21，cDNA文库包括该种生物的A. 某些蛋白质的结构基因B. 所有蛋白质的结构基因C. 所有结构基因D. 内含子和调控区22．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?A. 具有可诱导性B. 具有可转移性C. 细菌生长的任何时期都可以出现D. 不同细菌出现感受态的比例是不同的23．在简并引物的3′端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为A. Taq酶具有一定的不精确性B. 便于排除错误碱基的掺人C. 易于退火D. 易于重组连接24．变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是A. 氧化物会改变pH值B. 氧化物可使DNA的磷酸二酯键断裂C. 氧化物同DNA形成复合物D. 氧化物在DNA分离后不易除去(四) 是非题1. 基因表达的最终产物都是蛋白质。
miR-16在冠心病患者血清中表达及功能分析
㊃论著㊃通信作者:靳星,E m a i l :36815763@q q.c o m m i R -16在冠心病患者血清中表达及功能分析靳 星1,李文祎2,马 蓉1(1.隆尧县医院检验科,河北邢台055350;2.北京大学人民医院检验科,北京100044) 摘 要:目的 探讨血浆m i R -16与冠心病的关系,并阐明该m i R 对血管平滑肌细胞增殖表型的调控作用㊂方法随机选取冠心病患者43例及健康对照49例,通过实时荧光定量聚合酶链反应(P C R )检测血浆m i R -16的表达强度㊂将m i R -16类似物转染人血管平滑肌细胞,通过C C K -8实验检测细胞的增殖活力,通过蛋白印迹检测细胞周期蛋白(c yc l i n )D 1㊁D 2和E 1的表达㊂结果 冠心病患者血浆m i R -16表达水平显著低于对照组(P <0.05)㊂过表达m i R -16可显著抑制血管平滑肌细胞的增殖,并下调c yc l i nD 1㊁D 2和E 1的表达㊂结论 m i R -16在冠心病患者血浆中表达降低,该m i R 可能通过靶向抑制细胞周期蛋白c yc l i n D 1㊁D 2和E 1的表达抑制血管平滑肌细胞增殖㊂关键词:m i c r o R N A -16;冠状动脉疾病;增殖;细胞周期蛋白类中图分类号:R 541.4 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2020)12-1093-04d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2020.12.006E x p r e s s i o na n d f u n c t i o na n a l y s i s o fm i R -16i n t h e s e r u mo f p a t i e n t sw i t h c o r o n a r y he a r t d i s e a s e J i nX i n g 1,L iW e n y i 2,M aR o n g11.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,L o n g y a oC o u n t y H o s p i t a l ,X i n g t a i 055350,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,P e k i n g U n i v e r s i t y P e o p l e 'sH o s p i t a l ,B e i j i n g 100044,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :J i nX i n g ,E m a i l :36815763@q q .c o m A B S T R A C T :O b je c t i v e T o e x p l o r e t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a s m a m i R -16a n dc o r o n a r y h e a r td i s e a s e (C H D ),a n d t o c l a r if y t h e r eg u l a t i o n o fm i R -16o n th e p r o li f e r a t i o n p h e n o t y p e o f v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s .M e t h o d s F o r t y -t h r e e p a t i e n t sw i t hc o r o n a r y h e a r t d i s e a s e a n d49h e a l t h y v o l u n t e e r sw e r e r a n d o m l y s e l e c t e d .T h e e x p r e s s i o n i n t e n s i t yo f p l a s m a m i R -16w a sd e t e c t e d b y r e a l -t i m ef l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n (P C R ).m i R -16a n a l o g u e sw e r e t r a n s f e c t e di n t oh u m a nv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s ,a n dt h e p r o l i f e r a t i o na c t i v i t y o f t h ec e l l sw a s d e t e c t e db y C C K -8e x p e r i m e n t .T h e e x p r e s s i o no f c y c l i nD 1,D 2a n dE 1w e r e d e t e c t e db y we s t e r nb l o t .R e s u l t s T h e e x p r e s s i o nof p l a s m a m i R -16i n C H D p a t i e n t s w a ss ig n i f i c a n t l y l o w e rth a nt h a ti nc o n t r o l g r o u p (P <0.05).O v e r e x p r e s s i o no fm i R -16s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e dt h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l sa n dd o w n -r e g u l a t e d t h e e x p r e s s i o no fc y c l i n D 1,D 2a n dE 1.C o n c l u s i o n m i R -16e x p r e s s i o n w a sd e c r e a s e di n p l a s m ao f p a t i e n t s w i t h C H D.T h i sm i R m a y i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o n o f v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s t h r o u g h t a r g e t i n g t h e e x p r e s s i o n o f c yc l i n D 1,D 2a n dE 1.K E Y W O R D S :m i c r o R N A -16;c o r o n a r y d i s e a s e ;p r o l i f e r a t i o n ;c yc l i n s 微小R N A (m i c r o R N A ,m i R )是属于小分子非编码R N A 的一种,它们可以通过与靶基因的3'U T R 结合抑制其表达㊂近来研究表明,m i R 的表达变化与多种疾病相关㊂在冠心病中,也存在多种上调或下调性变化的m i R ,它们共同参与该病的调控过程㊂m i R -16是一种广泛表达的m i R ,血浆中也可检测到该m i R 的表达㊂研究证实,m i R -16的表达在多种疾病,如肿瘤㊁心肌肥厚㊁脑中风等[1-3]㊂在心肌肥厚过程中,m i R -16的表达下调,并因此促进靶基因细胞周期蛋白(c yc l i n )D 1㊁D 2㊁E 1表达的上调,加重心肌肥厚[3]㊂然而,m i R -16在血管平滑肌中的作用尚不清楚,本研究分别通过检测冠心病患者血浆m i R -16的表达变化,探讨该m i R 与冠心病的关系,并通过研究该m i R 对血管平滑肌增殖的影响初步探讨该m i R 的作用机制,旨在为冠心病的诊断㊁治疗提供实验依据㊂1 资料与方法1.1 研究对象 随机选取在2016年9月至2017年10月于隆尧县医院心内科住院并经冠状动脉造影确诊为冠心病患者43例,男30例,女13例,年龄(65.8ʃ11.3)岁;对照组为同期经心电图㊁超声心动图等检测排除心脏疾病,来我院体检的健康人49例,,男23例,女26例,年龄(60.4ʃ12.8)岁㊂1.2 样品采集 各组研究对象均抽取清晨空腹外周静脉血4m l ,并收集于E D T A -K 2抗凝管中㊂采㊃3901㊃‘临床荟萃“ 2020年12月20日第35卷第12期 C l i n i c a l F o c u s ,D e c e m b e r 20,2020,V o l 35,N o .12Copyright ©博看网. All Rights Reserved.血后,迅速在4ħ下以3000r/m i n离心,收集上层血浆,分装于冻存管中,保存于-80ħ冰箱保存备用㊂1.3血浆m i R提取及检测采用m i r V a n a血浆m i R提取试剂盒,按照使用说明加入线虫C e l-m i R-39类似物作为内参,依据试剂盒的使用说明提取血浆总R N A㊂用N a n o D r o p检测R N A浓度,经过稀释㊁浓度矫正后采用A B I公司m i c r o R N A逆转录试剂盒将各样品中m i R-16和C e l-m i R-39进行逆转录反应㊂采用T a q M a n探针实时荧光定量P C R法检测各样品中m i R-16及C e l-m i R-39的C t值,以m i R-16与C e l-m i R-39的相对C t值表示m i R-16在各样品中的相对表达强度㊂按对照组m i R-16的相对表达强度进行归一化处理,观察各组相对于对照组血浆m i R-16的表达变化㊂1.4细胞处理与活力检测将人脐静脉血管平滑肌细胞传代㊁细胞计数,并稀释至100000个细胞/m l 的密度,迅速接种于96孔板,每孔100μl细胞悬液㊂待细胞贴壁后将细胞培养液血清浓度降至0.1%,以同步化细胞周期㊂血清饥饿24h后采用L i p o f e c t a m i n3000试剂分别将m i R-16类似物及其阴性对照转染平滑肌细胞㊂转染后24h在相应的细胞中加入P D G F-B B(终浓度10n m o l/L)处理㊂转染后48h,观察细胞状态,并在每个孔中加入10μl的C C K-8试剂,将96孔板再次放入细胞培养箱中孵育2h,取出观察细胞悬液颜色变化,放置于酶标仪上并检测450n m处吸光度数值㊂各组的吸光度数值经过归一化处理后分析其变化情况,并以此表示各组细胞的细胞活力变化㊂1.5靶基因检测将人脐静脉平滑肌细胞接种于12孔板,采用L i p o f e c t a m i n3000试剂转染细胞, 48h后收集各组细胞,并采用W e s t e r n印迹检测各组细胞中c y c l i nD1㊁c y c l i nD2和c y c l i nE1的表达强度㊂具体步骤如下:将各组细胞加入R I P A裂解液,低温静置㊁震荡,充分裂解,并在4ħ条件下以12000 r/m i n进行离心㊂取上清液转移至新的离心管中,采用B C A法进行蛋白定量㊂定量后,采用R I P A裂解液稀释至2μg/μl的工作液,加入5X上样缓冲液之后,在100ħ中加热煮沸5m i n㊂之后,迅速置于冰上降温,短暂离心后将各组样品加入到S D S-P A G E 胶中进行电泳分离(浓缩胶80V30m i n,分离胶120 V60m i n)㊂之后,将胶取出,置于电转仪上进行恒流电转膜(300m A,120m i n)㊂电转结束后,取出N C膜,采用丽春红工作液染色,并采用5%的脱脂牛奶室温封闭1h㊂封闭结束后,采用含有抗c y c l i n D1㊁c y c l i nD2㊁c y c l i nE1及G A P D H的一抗稀释液(1ʒ1000)于4ħ摇床上缓慢孵育过夜㊂次日,采用T B S T溶液漂洗4次,并用H R P标记的山羊抗兔二抗室温孵育1h㊂采用T B S T溶液再次漂洗4次后加入化学发光底物显色㊂通过Q u a n t i t y O n e软件拍摄㊁记录图像并扫描各条带的灰度值㊂以G A P D H 为内参,以上述蛋白与G A P D H灰度的比值计算其相对表达量㊂1.6统计学方法采用S P S S19.0进行统计学分析,数据均用均数ʃ标准差(x-ʃs)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1冠心病患者血浆m i R-16水平下调为探讨m i R-16在冠心病患者中的变化,采用实时荧光定量P C R法检测血浆标本中该m i R的变化㊂血浆m i R-16的表达在冠心病患者中显著下调(1.00ʃ0.42v s 0.75ʃ0.23,P<0.05),表明m i R-16表达的下调可能与冠心病有关,见图1㊂图1血浆m i R-16的表达强度*与对照组比较P<0.05 2.2 m i R-16对血管平滑肌增殖的调控作用为探讨m i R-16对血管平滑肌增殖的作用,采用C C K-8法检测过表达m i R-16后血管平滑肌细胞增殖的变化㊂结果发现,在转染m i R-16类似物48h后,血管平滑肌细胞的增殖活力显著下降,是对照组的23.1%,见图2㊂在此基础上采用血小板源生生长因子P D G F-B B(50n g/L)刺激血管平滑肌增殖,观察到过表达m i R-16类似物的血管平滑肌细胞增殖活力是阴性对照组的53.8%,表明过表达m i R-16后可部分对抗P D G F-B B诱导的细胞增殖,见图2㊂采用W e s t e r n印迹对其靶基因c y c l i nD1㊁D2及E1进行检测,发现过表达m i R-16后可显著降低上述基因的表达,见图3㊂㊃4901㊃‘临床荟萃“2020年12月20日第35卷第12期 C l i n i c a l F o c u s,D e c e m b e r20,2020,V o l35,N o.12Copyright©博看网. All Rights Reserved.图2 m i R -16对细胞增殖活力的影响 采用C C K -8检测细胞的增殖活力图3 m i R -16对细胞周期蛋白表达的调控作用 采用蛋白印迹检测过表达m i R -16后血管平滑肌细胞中c yc l i nD 1㊁D 2及E 1表达的变化(a )㊂进行灰度扫描后以G A P D H 为内参,计算各组相对表达强度(b )㊂**与对照组比较P <0.013 讨 论m i R 是一种细胞内的小分子非编码R N A ,其长度大约为21~23n t ㊂目前的研究发现,m i R 参与了胞内多种生物学过程的调控,如细胞周期及增殖㊁凋亡㊁自噬等[4-8]㊂初始的m i R 转录产物较长,经胞内酶切处理后形成成熟体的m i R ㊂这些m i R 可与其靶基因的3'U T R 结合进而影响后者的表达㊂目前研究证实,m i R 主要发挥抑制靶基因表达的功能,在哺乳动物细胞中,3'U T R 结合m i R 后主要通过抑制该靶基因的翻译而影响其表达㊂m i R 是一种小分子调控分子,因此其可以较容易的从细胞内转移至胞外以及循环血中㊂相较于大多数R N A 分子,m i R 由于分子量较小而具有较高的稳定性,在转移至循环血中时可以在较长时间稳定存在㊂因此,循环血中的m i R 就有可能被远隔部位的细胞重新摄取,并转运至细胞内发挥相应的生物学效应㊂基于该特性,循环血m i R 的检测为疾病的诊断以及疾病发病的分子机制研究提供了新方法[9]㊂目前研究表明,多种疾病如心血管疾病㊁肿瘤等,其患者循环血中特定类型的m i R 表达均可呈现显著变化[10-16]㊂本研究发现,冠心病患者血浆m i R -16表达水平呈显著下调趋势,由此提示该m i R 很可能在冠心病发病及进展过程中起到重要的调控作用㊂m i R -16是一种调控细胞周期的小分子非编码R N A ,其高表达可显著抑制多种c yc l i n s 的表达,进而抑制细胞增殖[1,17-20]㊂研究表明,在肿瘤细胞中,m i R -16可负向调控c y c l i nD 1㊁c y c l i nD 2及c yc l i nE 1的表达[3]㊂我们的研究也发现,在血管平滑肌细胞中过表达m i R -16可显著抑制该细胞增殖,并显著下调c y c l i nD 1㊁D 2及c y c l i nE 1的表达强度㊂血管平滑肌细胞过度增殖是冠状动脉狭窄的病理机制之一㊂当血管内皮受到氧化应激㊁炎症损伤时,其功能紊乱,同时导致血管平滑肌细胞的表型转换,即由收缩型转变为分泌型㊂分泌型的血管平滑肌细胞逐渐失去其原有的形态和功能,获得细胞增殖㊁迁移㊁合成分泌的能力㊂发生表型转换后的血管平滑肌细胞合成细胞外基质成分的能力增加,进而加重血管的重塑和管腔狭窄㊂在本研究中,我们不仅发现在冠心病患者循环血中m i R -16出现显著降低,还发现该m i R 过表达后抑制了血管平滑肌细胞的增殖以及细胞周期蛋白c y c l i nD 1㊁c y c l i nD 2及c y c l i nE 1的表达下调㊂由此提示,该m i R 很可能发挥了抑制冠心病的作用㊂通过分子生物学手段阻断血管平滑肌细胞的增殖很可能是治疗冠心病的有效策略㊂我们的研究表明,过表达m i R -16后可显著阻断血管平滑肌细胞增殖,该过程很可能是通过靶向抑制细胞周期蛋白c y c l i nD 1㊁c y c l i nD 2及c y c l i nE 1所致㊂然而,本研究还存在一些局限性:首先,本研究中病例数目较少,需要在更大规模的人群中做相关分析;其次,本研究尚未在动物模型上做相关验证,尚不能完全阐明m i R -16对冠心病发展以及血管平滑肌细胞增殖的直接关系㊂因此,关于m i R -16与冠心病之间的分子机制仍是今后研究的重点㊂综上所述,m i R -16是一种冠心病及血管平滑肌细胞增殖相关m i R -16,其表达在冠心病患者中下调㊂该m i R 可通过抑制多种细胞周期调控蛋白抑制㊃5901㊃‘临床荟萃“ 2020年12月20日第35卷第12期 C l i n i c a l F o c u s ,D e c e m b e r 20,2020,V o l 35,N o .12Copyright ©博看网. All Rights Reserved.血管平滑肌细胞的增殖,m i R-16很可能是冠心病防治的潜在靶点㊂参考文献:[1] V e n t u r u t t iL,C o r d o R u s s o R I,R i v a s MA,e ta l.M i r-16m e d i a t e s t r a s t u z u m a ba n d l a p a t i n i b r e s p o n s e i n e r b b-2-p o s i t i v eb r e a s t a n d g a s t r i cc a n c e rv i a i t sn o v e l t a r g e t sc c n j a n df u b p1[J].O n c o g e n e,2016,35(48):6189-6202.[2] R a i n e rT H,L e u n g L Y,C h a nC P,e ta l.P l a s m a m i r-124-3pa n d m i r-16c o n c e n t r a t i o n s a s p r o g n o s t i c m a r k e r si n a c u t es t r o k e[J].C l i nB i o c h e m,2016,49:663-668.[3] H u a n g S,Z o uX,Z h uJ N,e t a l.A t t e n u a t i o no fm i c r o r n a-16d e r e p r e s s e s t h e c y c l i n s d1,d2a n d e1t o p r o v o k e c a r d i o m y o c y t eh y p e r t r o p h y[J].JC e l lM o lM e d,2015,19:608-619.[4]赵雷,肖二彬,梁景卫,等.m i R-655-3p通过靶向抑制Z E B1对头颈鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭能力的影响[J].河北医学, 2020,26(6):921-925.[5]李永红,刘伟仪,李伟,等.m i R N A-184在胶质瘤组织中的表达及其对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响[J].现代肿瘤医学, 2020,28(14):2385-2389.[6]刘志刚,李琦军,王飞,等.m i R-140-5p通过N F-κB通路调控人骨关节炎软骨细胞自噬的研究[J].现代中西医结合杂志, 2020,29(19):2089-2093.[7]王毅超,谢姣贵,潘印,等.m i R N A-224-5p靶向J A G1抑制乳腺癌细胞自噬活性的机制研究[J].浙江医学,2020,42(7): 670-673.[8]武君,梁艳,张森森,等.m i R N A-34a靶向调控叉头框蛋白P1对活化B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞凋亡的影响[J].癌症进展,2020,18(12):1211-1216.[9]张青,陈婷.m i c r o R N A s调控干细胞血管向分化的研究进展[J].临床荟萃,2020,35(5):466-471.[10] A l-K a f a j i G,A l-M a h r o o s G,A l-M u h t a r e s h H A,e t a l.C i r c u l a t i n g e n d o t h e l i u m-e n r i c h e d m i c r o r n a-126a sa p o t e n t i a lb i o m a r k e rf o rc o r o n a r y a r t e r yd i se a s e i n t y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s p a t i e n t s[J].B i o m a r k e r s,2016,20:1-40. 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基因转录激活复合物的调控机制及其生物学意义研究
基因转录激活复合物的调控机制及其生物学意义研究基因转录激活复合物（Transcriptional Activation Complex，TAC）是一种重要的调控基因表达的蛋白质复合物，它能够识别特定的DNA序列并结合到上面，从而启动转录过程。
TAC不仅参与了细胞周期的调节和分化过程中基因表达的调控，还与许多人类疾病的发生和发展密切相关。
因此，研究基因转录激活复合物的调控机制以及其生物学意义具有重要的科学意义和临床意义。
一、基因转录激活复合物的组成基因转录激活复合物是一种复杂的蛋白质复合物，主要包括转录激活因子（Transcription Activator，TA）、转录调节因子（Transcriptional Regulator，TR）和共激活因子（Coactivator）。
其中，TA是一种能够结合到DNA上的蛋白质，TR是一种调节TA活性的蛋白质，而Coactivator则是一种协同TA和TR的蛋白质，能够促进TA结合到DNA上，并增强转录的效率。
二、基因转录激活复合物的调控机制1.蛋白质相互作用基因转录激活复合物中不同蛋白质之间通过相互作用形成复合物，这种相互作用的组合模式是构成复杂蛋白质结构的重要基础。
例如，TA和TR之间通过蛋白质相互作用的方式相互作用，从而协同调节某些特定基因的表达。
2.信号转导途径信号转导途径是细胞中常见的一种转录调控机制。
通过上游信号转导途径的激活、传导、放大或衰减等过程，可以改变基因表达水平，从而实现细胞形态发生、分化和适应环境等生理功能的调整。
3.甲基化修饰DNA甲基化是一种常见的DNA修饰方式，它可以调控基因的表达。
许多转录因子和共激活因子能够识别和结合甲基化的DNA序列，从而调控基因的表达。
例如，Coactivator PGC-1a能够结合到DNA上的甲基化序列，促进基因转录。
三、基因转录激活复合物的生物学意义基因转录激活复合物的调控水平与细胞的生长、分化和去向密切相关。
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摘 要 ： 目的 ： 探讨基本转 录元件结合蛋 白２ Ｂ Ｅ ２ 反义 Ｒ Ａ对血管平 滑肌细胞（ Ｓ （ＴＢ ） 酶 消 化 法 培 养 大 鼠 Ｖ ＭＣ； 过 Ｒ －Ｃ 法 检 测 血 清 诱 导 的 Ｖ ＭＣ 表 型 标 记 基 因 （ Ｍａ 和 采 Ｓ 通 ＴＰ Ｒ Ｓ Ｓ Ａ Ｓ ｅ ｂ ｍＲ Ａ表 达 的变 化 ； 反 义 Ｂ Ｅ ２重 组 腺 病 毒 转 染 Ｖ ＭＣ 后 ， 用 Ｒ ．Ｃ 法 检 测 Ｓ ｔ 和 Ｓ ｍ Ｍｍ ） Ｎ 用 ＴＢ Ｓ 采 ＴＰ Ｒ Ｍｏ Ａ Ｍｅ ｂ的
ｍＲ Ａ Ｎ 表达 ， 用免疫细胞化学技术检测 Ｓ ｔ Ｍｏ Ａ和 Ｓ ｍ Ｍｅ ｂ蛋 白表达。 结 果 ： 血清刺 激后 ，Ｍｅ ｂ ｍ Ｎ Ｓ ｍ Ｒ Ａ表 达增加 ， 而 Ｓ Ａ ｍＲ Ａ表达减少 ；Ｔ Ｂ Ｍａ Ｎ Ｂ Ｅ ２反义基 因转染显著抑制血 清诱 导的 Ｓ ｍ Ｒ Ａ和蛋白表 达的增加 以及 Ｓ ａ Ｍｅ ｂｍ Ｎ Ｍ Ａ 表 达的减少 。 结论 ：Ｔ Ｂ Ｂ Ｅ ２反义 Ｒ Ａ可显著抑制血 清诱 导的 Ｖ ＭＣ表型转化 。 Ｎ Ｓ 关键词 ： 基本转录元件结合蛋 白２ 反义 Ｒ Ａ； 血管平 滑肌 细胞 ； 表型转化 ； Ｎ 中图分类号 ： Ｑ ８ ７ 文献标识码 ： Ａ 文章编 号 ： １０ ．１９ ２０ ）６０ ７ －３ ０ ８８９ （ ０ ８ ０ －５７０
ＬＩＤｅ， ＨＥ Ｇｕ — ｉｎ ｏ ｘ ａ ｇ，ＴＡＮＧ ｎ Ｂｉ ｇ，ＴＡＮＧ Ｂｏ
（ ． ｅａｔ ｅｔ ｆＣ ｒｉ ｏ ｙｏ Ｓ ｕｈ ｅ ｏｐｔｌ ｔｅＴ ｉ ｌａｙＭｅ ｉ ｌＵ ｉ ｒ ｔ，Ｃ ｏｇ ｉｇＩ— １Ｄ ｐ ｒ ｎ ａｄｏ ｇ ｏ ｔｗ ｓＨ ｓｉ ，ｈ ｈｒ Ｍｉｔｒ ｄｃ ｎ ｅ ｉ ｍ ｏ ｌ ｆ ｔ ａ ｄ ｉ ａ ｖ ｓｙ ｈｎ ｑｎ ｎ ｓｔｔ ｏ Ｉｔ ｖ ｔ ｎ ｌ ａｄ ｌ ｙ ｈｎ ｑｎ ０ ０ ８ Ｃ ｉ ｔｕｅｆ ｎ ｅ ｅ ｉ ａ ｒｉ ｇ ，Ｃ ｏｇ ｉｇ４ ０ ３ ， ｈｎ ｉ ｒ ｎｏ Ｃ ｏ ｏ ａ） Ａｂｔａ ｔ Ｏ ｊｃｉ ： ｏｓ ｄ ｅｅ ｅｔ ｏ Ｔ Ｂ ｎｉ ｎｅＲ Ａ ｏ ｈｎ ｔｐ ｏ ｕａｉ ｆ ａ— ｓｒｃ ： ｂｅｔ ｅ Ｔ ｔ ｙｔ ｆ ｃ ｆ Ｅ ２ ａｔ ｅ ｓ Ｎ ｎｐ ｅｏｙ ｉ ｍ ｄ ｌｔ ｎｏ ｓ ｖ ｕ ｈ ｓ Ｂ ｓ ｃ ｏ ｖ
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・
论
著 ・
基 本 转 录 元 件 结 合 蛋 白 ２反 义 基 因转 染 对 血 管 平 滑 肌 细 胞 表 型 转 化 的影 响
李 德 ， 何 国祥 ， 唐 兵， 唐 波
（ 第三 军 医大学 西南 医 院心 内科 ， 庆市 介人 心脏 病学 研究 所 ， 庆 ４０ ３ ） 重 重 ０ ０ ８
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５ ７・ ７
第２卷 １
第 ６期
医 学 研 究 生 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｄｃ ｌ ｏ ｔｒ ｄ ａｅ ｏ ｒ ａ ｆＭｅ ｉａ ｓｇ ａ ｕ ｔｓ Ｐ
Ｖｏ ． Ｎｏ ６ １ ２１ ．
２０ ０ ８年 ６月
Ｊｎ２０ ｕ ．０ ８