阿魏酸钠对大鼠角膜新生血管的抑制作用研究

・５２６・　Ｃｈｉｎ　Ｏｐｈｔｈａｌ　Ｒｅｓ，Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．７　・实验研究・　阿魏酸钠对大鼠角膜新生血管的抑制作用研究　

陈丽华　江　萍　罗　彤　胡学斌　莫纯坚　王红俊　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｆｅｒｕｌａｔｅ　Ｃｈｅｎ　Ｌｉｈｕａ，Ｊｉａｎｇ　，Ｌｕｏ　Ｔｏｎｇ，Ｈｕ　Ｘｕｅｂｉｎ，Ｍｏ　Ｃｈｕｎｊｉａｎ，Ｗａｎｇ　Ｈｏｎｇｊｕｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｐｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｙｉｃｈａｎｇ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｉｒｓｔ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｃｈａｎｇ　４４３００３，Ｃｈｉｎａ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ（ＣＮＶ）ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｉｔｈｅｒｔｏ，　ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｓｔｉｌｌ　ｎｏ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｒｕｇｓ　ｗｉｔｈ　ｆｅｗ　ｓｉｄｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｉｔｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｆｅｒｕｌａｔｅ（ＳＦ）ｏｎ　ＣＮＶ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＣＮＶ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｓｕｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　４８　ｍａｌｅ　Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔｓ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　１２　ｒａｔｓ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ．０．０２５％ｏｒ　０．１％ＳＦ　ｅｙｅ　ｄｒｏｐｓ　ｗａｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ．ＰＢＳ　ｅｙｅ　ｄｒｏｐｓ　ｗａｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｓ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　０．１％　ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｅｙｅ　ｄｒｏｐｓ　ｆｏｒ　ｇｒｏｕｐ　Ｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ１．Ｖａｒｉｏｕｓ　ｅｙｅ　ｄｒｏｐｓ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｏｕｒ　ｔｉｍｅｓ　ｄａｉｌｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄａｙ　０—１２．Ｔｈｅ　ＣＮＶ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓｌｉｔ　ｌａｍｐ　ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＣＮＶ　ａｒｅａ　ｗａｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　３ｒｄ，６ｔｈ，９ｔｈ　ａｎｄ　１２ｎｄ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｒｎｅａｌ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　１２ｎｄ　ｄａｙ　ｆｏｒ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｃｏｒｎｅａ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＲＴ－ＰＣＲ）ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｓｓａｙ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ａｒｅａ　ｏｆ　ＣＮＶ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ，Ｃ　ａｎｄ　Ｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ａｎｄ　Ｄ　ｗａｓ　ｓｍａｌｌｅｒ　ｔｈａｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ（Ｐ＜０．０１）ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ，ｂｕｔ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｄ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ｗａｓ　ｍａｒｋｅｄｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ，Ｃ　ａｎｄ　Ｄ（Ｐ＜０．叭），ａｎｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｄ　（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ａ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｏｐｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＦ　ｈａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＮＶ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＳＦ　ｏｎ　ＶＥＧＦ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉ０ｎ：　ｓｏｄｉｕｍ　ｆｅｒｕｌａｔｅ：　ＶＥＧＦ　

摘要　目的探讨阿魏酸钠（ｓＦ）对角膜新生血管（ＣＮＶ）的抑制作用及其机制。方法　将不同质量浓度的ｓＦ用　于缝线诱导的大鼠ＣＮＶ模型，观察其抑制ＣＮＶ形成的效果，采用免疫组织化学法和ＲＴ－ＰＣＲ法检测血管内皮生长因子　（ＶＥＧＦ）蛋白和ｍＲＮＡ在角膜组织中的表达水平。　结果０．０２５％和０．１％ＳＦ治疗组ＣＮＶ面积均小于阴性对照组，以　后者更明显，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），０．１％ＳＦ治疗组与阳性对照组间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；免疫组织　化学显示ＶＥＧＦ在正常角膜不表达或在上皮基底细胞有弱表达，阴性对照组染色明显增强，０．１％ＳＦ治疗组表达明显减　弱；ＶＥＧＦｍＲＮＡ和蛋白水平表达有一致性。结论ｓＦ滴眼液能有效地抑制ＣＮＶ的生长，其抑制ＶＥＧＦ的表达可能是　ＳＦ抑制ＣＮＶ生成的一个重要机制。　’　关键词　角膜新生血管；阿魏酸钠；血管内皮生长因子　分类号Ｒ　７７２　文献标识码Ａ文章编号１００３－０８０８（２００８）０７－０５２６－０４　

角膜新生血管（ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）是　最常见的致盲原因之一，也是角膜移植术后发生排斥　反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上　作者单位：４４３００３宜昌，三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人　民医院眼视光学专科　通讯作者：江萍（Ｅｍａｉｌ：ｃｒｙｓｔａｌ２００５００９２０＠１２６．ｃｏｉｎ）　的主要治疗手段，但其易诱发角膜穿孔、青光眼等严重　并发症。阿魏酸钠（ｓｏｄｉｕｍ　ｆｅｒｕｌａｔｅ，ＳＦ）是桂皮酸的衍　生物之一，具有抗肿瘤性及非肿瘤性血管生成的作　用　Ｉ２　。本研究将ｓＦ用于缝线诱导的大鼠ＣＮＶ模　型，观察其抑制ＣＮＶ形成的效果，并对血管内皮生长　因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）的表达　

维普资讯 http://www.cqvip.com 眼科研究２００８年７月第２６卷第７期　进行了免疫组织化学和ＲＴ—ＰＣＲ研究。　１材料与方法　１．１实验动物　健康雄性ＳＤ大鼠４８只（购自华中科技大学同济　医学院动物实验中心），鼠龄８～９周，体重２２０～２５０　ｇ。　１．２　方法　１．２．１　滴眼液的配制　实验组滴眼液成分为注射用　ＳＦ（重庆药友制药有限公司）、１Ｏ％聚山梨酯２Ｏ　（Ｔｗｅｅｎ２０）、１％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）。用ＰＢＳ配制成　０．０２５％和０．１％质量浓度的ＳＦ滴眼液（质量浓度根　据前期体外实验剂量及预实验剂量而定），调ｐＨ至　７．４。阴性对照组滴眼液成分为１０％Ｔｗｅｅｎ２０、１％　ＤＭＳＯ，用ＰＢＳ配制，ｐＨ调至７．４　。密闭，遮光，４　ｑＣ　保存。　１．２．２动物模型的制备及分组　取４８只大鼠经３％　戊巴比妥钠（３０　ｍｇ／ｋｇ）全身麻醉后，检查所有鼠眼无　眼前节病变，用０．２５％氯霉素滴眼液冲洗结膜囊，常　规消毒，复方托品酰胺散瞳，０．５％丁卡因表面麻醉。　在手术显微镜下用１０－０聚胺酯缝线在右眼上方角膜　（１　１、１２、１点钟３个位置）象限间断缝合３针，自距离　角膜缘略＜２．０　ＩｎＩｎ（圆规定位）向瞳孔中心方向进针，　穿过角膜基质约１．５　ｉｎｎ，线距１　ＩｎＩｎ，缝线头长约　１　ＩｎＩｎ。缝针尽量避免进入前房。术后每日滴０．２５％氯　霉素滴眼液３次。４８只大鼠随机分为４组（每组各１２　只）：Ａ组（ＰＢＳ阴性对照组）、Ｂ组（０．０２５％ＳＦ滴眼液　治疗组）、Ｃ组（０．１％ＳＦ滴眼液治疗组）、Ｄ组（０．１％　地塞米松磷酸钠滴眼液阳性对照组）。各组右眼均于　缝线后立即局部滴眼，每日４次（８：００、１２：００、１６：００、　２Ｏ：ｏ０），每次１滴，共１２　ｄ。　１．２．３　ＣＮＶ观察与测量　各组于术后第３、６、９、１２　ｄ　用裂隙灯显微镜观察ＣＮＶ生长情况，圆规测量长入角　膜的ＣＮＶ长度（以连续且弯曲度小、并与角膜缘切线　垂直的ＣＮＶ长度为准）。计算ＣＮＶ生长面积（溃疡角　膜除外）公式　：Ｓ＝Ｃ／１２×３．１４１６×［ｒ　一（ｒ—Ｚ）　］，　ｓ为ＣＮＶ生长面积，ｃ为ＣＮＶ网的跨圆周钟点数，ｒ为　角膜半径，ｆ为ＣＮＶ长度。　１．２．４组织病理学检查术后第１２　ｄ过量麻醉处死　大鼠，迅速摘除眼球，在显徽镜下剪下带１　ＩｎＩｎ宽巩膜　的角膜组织，任取其中１／２片存于液氮罐中备ＲＴ—ＰＣＲ　用。另１／２片置于１０％中性甲醛中固定２４　ｈ，常规脱　水、透明、浸蜡、石蜡包埋，４　ｍ厚连续切片，苏木精一　伊红染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。　１．２．５　免疫组织化学检测ＶＥＧＦ的表达　石蜡切片　按ＳＰ试剂盒说明进行免疫组织化学操作，一抗（１：５０　稀释）为兔抗ＶＥＧＦ多克隆抗体，二抗为山羊抗兔ｓＰ　试剂盒（均为福建迈新公司提供）。阴性对照以ＰＢＳ　代替一抗，其他条件均相同。抗ＶＥＧＦ抗体染色阳性　的细胞胞浆呈程度不同、基本均匀的棕黄色粗大颗粒　反应，反之则为染色阴性。采用Ｌｅｉｃａ　Ｑｗｉｎ图像分析　系统对每张切片随机选取５个不重复的高倍视野，利　用ｈｎａｇｅ—Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ　５．０专业图像分析软件计算平均积　分光密度（ａｖｅｒａｇｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ，ＡＩＯＤ）。　１．２．６　ＲＴ—ＰＣＲ法检测角膜组织中ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ的表　达用Ｔｒｉｚｏｌ　ＲＮＡ提取试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）　对保存在液氮中的角膜组织总ＲＮＡ进行抽提与纯化，　然后逆转录为ｃＤＮＡ。ＲＴ—ＰＣＲ按照试剂盒（日本　ＴａＫａＲａ公司）说明书进行操作，采用５Ｏ　Ｌ反应体系，　设定Ｂ—ａｃｔｉｎ为内参照。ＰＣＲ反应条件：９４　ｑＣ变性　４　ｍｉｎ后，９４　ｑＣ　３０　Ｓ，５０　ｏｃ　４０　Ｓ和７２　ｑＣ　４０　Ｓ，顺序循　环３５次，最后７２　ｑＣ延伸７　ｍｉｎ。２％琼脂糖凝胶电泳，　凝胶自动成像系统上摄像并分析各条带吸光度值（基　因表达值＝ＶＥＧＦ／１３．ａｃｔｉｎ）。ＶＥＧＦ和Ｂ—ａｃｔｉｎ引物由　大连宝生物工程有限公司合成。ＶＥＧＦ上游引物：５’一　ＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＴ一３’，下游弓Ｉ物：５’一　ＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴ一３’，扩增片断为３００　ｂｐ；Ｂ—　ａｃｔｉｎ上游弓Ｉ物：５’一ＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡ一３’，下　游引物：５’一ＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ１ｖｒ一３’，扩增片断　为４１５　ｂｐ。　１．３统计学方法　数据以ｘ　４－Ｓ表示，采用ＳＰＳＳ　１２．０统计学软件进　行处理。对不同组大鼠角膜缝线后不同时间ＣＮＶ面　积的比较和ＶＥＧＦ及其ｍＲＮＡ表达的总体差异比较　行两因素方差分析，组间的多重比较采用ＳＮＫ—ｑ检　验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。