二、微生物菌种选育11

选择简便有效的诱变剂
紫外线
接种
培养
选择优良突变株
培养
出发菌株 含诱变剂的液体培养基 接种分离
常用ห้องสมุดไป่ตู้诱变剂
物理诱变剂：紫外线，X射线，β射线、γ射线及 等离子体等；
化学诱变剂：亚硝基胍，硫酸乙酯，5-溴尿嘧啶， 亚硝酸等；
ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪
常用的诱变剂
即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他 粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变 异。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物 体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多 化学性质十分活跃的自由原子或自由基团 [1] 。 它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分 子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由 此又影响到细胞内的一些生化过程，如 DNA合成 的中止、各种酶活性的改变等，使各部分结构进 一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。 由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数
转化发生的条件
① 受体细胞要处于感受态 ② 转化因子大小适宜（分子量1× 107 D 左右） ③ 菌株间的亲缘关系密切
噬菌体感染实验
原理 步骤
DNA只含P不含S
Pr 只含S不含P
1：用含同位素Ｓ35, P32的培养基培养大肠杆菌 2：T2感染上述大肠杆菌 S35P32标记
吸附
10分钟后 侵染
离心
上清液 沉淀
结果：上清液中含15%放射性P；沉淀中含85%放射性P 上清液中含75%放射性S；沉淀中含25%放射性S
植物病毒的重建实验
诱变剂处理 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
夹层培养法 逐渐检出法 影印接种法
限量补充培养法 菌丝过滤法
与突变株的筛选相关的几个概念
三类遗传型
野生型 [A+B+] 营养缺陷型 [A+B-] 原养型 [A+B+]
基本培养基 [-] 相关培养基 完全培养基 [+]
补充培养基
与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基
NH2
直接引起置 OH
O
C
换的诱变剂 C
C
HNO2
异构
腺嘌呤
次黄嘌呤(He) 次黄嘌呤(Hk)
H..k
A..
H..e H..k
C
T
T
T
A..
T
H..k C
G.. C
碱基的置换– 点突变
5-BU
酮式 Br
CO Br
C O H 5-BU
烯醇式
间接引起置换的诱变剂A..
A.. T
G.. G..
G.. C
活的S菌
抽血分离
转化实验（2）细菌培养实验
ＳⅢ〖杀死〗 ＲⅡ〖活菌〗
ＳⅢ〖杀死〗 ＲⅡ〖活菌〗
体外培养 无菌落生长
体外培养
ＲⅡ菌落
体外混合培养 ＲⅡ菌落多 ＳⅢ菌落少
转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验
活R菌+ S菌无细胞抽提液
活R菌 + S菌DNA
活R菌 +
S菌Pr S菌多糖
大量R菌落
S菌落 R菌落
4100个基因，4.7×106bp 遗传信息的连续性 功能相关的结构基因组成操纵子 结构基因单拷贝及rRNA多拷贝 基因的重复序列少而短
酵母菌基因组
染色体 长度Kb 基因数
染色体 长度Kb 基因数
1
230
4
2
423
13
3
173
10
4
814
27
439 231
10
745 387
24
666 334
16
1078 550
微生物突变体的主要类型
形态突变型
按突变 实质分
生化突变型
菌落形态突变型 菌体形态突变型 营养突变体(营养缺陷型) 抗性突变体 条件致死突变体 抗原突变型 产量突变型
突变率
突变几率：10-6~10-9
出发菌株
长出突变株
含诱变剂的培养基
突变的特点
自发性 稀有性 独立性 诱变性 稳定性 可逆性
碱基的置换 – 点突变
氦气是最小的单原子分子，其激发后释放出来的活性粒子能量最高，达到19.8eV， 而其他气体等离子体的活性粒子能量均比氦等离子体低很多。
挑选优良的出发菌株
生产中用过的自发变异菌株 具有有利性状的菌株 已发生其他变异的菌株 最终产物代谢量高的菌株
处理单孢子（或单细胞）悬液
芽孢杆菌应处理芽孢 放线菌，霉菌应处理孢子 细菌指数期，放线菌和霉菌孢子要 稍加萌发后使用 均匀悬夜
概念：转化、转化因子和感受态 转化过程
转化(transformation)
受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA 片段，并把它整合到自己的基因组中，细胞 部分遗传性状发生变化的现象叫转化。
活R菌或死S菌
活
肺炎双球菌
活S菌
死
活R菌和热死S菌
死
活的S菌
抽血分离
转化因子：来自供体的游离DNA片段。 感受态：理化方法诱导，受体细胞能从环境吸取 外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
A A T C AA T AG
CYTOLPLASM
U U A GAU AUC mRNA
mRNA leaves the nucleus through the nuclear pore.
蛋白质合成(protein synthesize)
DNA
G C
A T
T A
mRNA
GAU
天冬 氨酸
大肠杆菌基因组
甲ＲＮＡ＋乙Ｐr → 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 ＲＮＡ＋甲Ｐr → 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒
TMV
HRV 原始株 拆开
重建
感染
HRV
TMV 分离纯化
遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式
遗传物 质类型
核染色体 核外染色体
真核生物细胞器 原核生物质粒
基因是一段DNA
基因Ⅰ
基因Ⅱ
染色体
22
5
292
13
6
136
10
7
573
33
8
291
11
924 487
21
784 421
15
1092 571
20
948 499
17
返回核染色体
原核生物基因调控系统
RP
O 结构基因
启动基因 操纵基因 调节
基因
操纵子
原核生物遗传物质
质粒
原核 细胞
基因突变
突变类型 突变率 突变特点 突变机制
碱基的置换 移码突变 染色体畸变
基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求 的最低成分的合成培养基。
完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的 天然或半合成培养基。
补充培养基（SM）：在MM中有针对性地加入一或几种营养 成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。
与营养缺陷型有关的三类遗传型
野生型 [A+B+]：从自然界中分离到的微生物在其发生营 养缺陷型突变前的原始菌株
第二轮 诱变剂
五个出发菌株 处理
40株 44株4000株株（每株初1筛瓶）选出50株（每复株筛4瓶）选出5 株 40株
设计高效筛选方案或方法
变色圈法，透明圈法，生长圈法，抑菌圈法， 梯度平板法
透明圈
抑菌圈
设计高效筛选方案或方法 高产突变菌株的筛选方法 青霉素浓缩法 抗性突变体的筛选方法 梯度培养皿法 营养缺陷型的的筛选方法
简介
王玉华 博士，教授，博士生导师 现工作单位：食品科学与工程学院
联系方式： E-mail: yuhua-ww@163.com cell phone：13086813443
高级食品微生物学
课时安排：
教学安排
✓ 理论课时：28学时 ✓ 实验课时：17学时
教学内容：
➢ 食品微生物发展现状与趋势（4学时） ➢ 微生物菌种选育（4学时） ➢ 微生物的代谢调控（4学时） ➢ 微生物菌种资源开发及其在食品中的应用（8学时） ➢ 微生物新技术及其在食品中的应用（8学时）
发酵单位(u/mL)
100 250 500 850 850 8000 2万 5万 10万以上
效价：指有效成分的浓度。1ug/uL称为1 单位
诱变育种的基本过程
选择合适的出发菌株 ↓
制备待处理的菌悬液 ↓
诱变处理 ↓
筛选 ↓
保藏和扩大试验
诱变育种的原则
选择简便有效的诱变剂 选优良的出发菌株 处理单孢子（或单细胞）悬液 选用最适剂量 利用复合处理的协同效应 设计高效筛选方案或方法
营养缺陷型[A+B-]：野生型菌株经诱变处理后，丧失了合成 某种酶的能力，只能在加有该酶合成产物的培养基上生长 的突变株。
原养型[A+B+]：营养缺陷型经回变或重组后产生的菌株。
夹层培养法及结果
基本培养基
培养
培养
小菌落即营养缺陷型
补充培养基
逐个检出法
菌种
涂 含诱变剂的液体培养基 布
培
养
完全培养基
春琼 日脂 霉块 素培 高养 产法 菌筛 种选
突变
春日链霉菌 孢子悬液
含供试菌种 · （拮抗对象）
的琼脂平板
高通量筛选
酶标仪
青霉素浓缩法
抗青霉素菌落
培养基(含青霉素)
接入敏感菌液
（含抗性突变株）
涂布
培养
梯度培养皿法
含异烟肼
抗结核药物
接敏感菌 含突变株
弱抗性 强抗性 中抗性
营养缺陷型的筛选
与突变株的筛选相关的几个概念
计算出 存活率 突变率 正变率 高产率
投产率
微生物的菌种选育
生物质原料
诱变育种
基因工程 原生质体融合
代谢网络
其他 如：代谢工程，Genome－shuffling等 发酵产品
诱变育种
诱变育种的基本过程 诱变育种的原则
诱变育种
从青霉素产量看诱变育种
时间
1943 1943 1943 1945 1947 1955 1971 1977 目前
氦目气是的最小变的异单原即子染分子色，其体激突发后变释，放出而来的D活N性A粒分子能子量结最高构，中达到碱19.基8eV， 而的其他变气体化等则离子造体成的活基性因粒子突能变量均。比氦等离子体低很多。
常压室温等离子体诱变育种技术广泛应用于细 菌、真菌、放线菌、霉菌、藻类、大型真菌、 植物及动物细胞。以高纯氦气为工作气体，利 用射频辉光放电原理，在常温常压状态下产生 高能量的等离子体，其富含的高能化学活性粒 子能够对菌株/植物/动物细胞产生高强度遗传 物质损失，进而利用细胞启动的SOS高容错率 修复机制，产生种类多样的错配位点，最终形 成了遗传稳定、种类丰富的突变株。
C BU A..
烯醇式 BU
A.. T BU A..
A.. BU
酮式
酮式
T
A.. T
G.. BU
G.. C
烯醇式
点突变—单点突变、多位点突变
点突变—饱和突变、定向进化
移码突变
DNA片段的缺失和插入
ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC
增添一个碱基 ABC ABC ABX CBA CBA CBA CBA CBA
CC GGA T
AA C TTG
CA C G TAG
外源DNA片 段
微生物的基因重组
• 原核微生物的基因重组 通过转化、转导、接合、原生质体融合
等形式进行部分遗传物质转移和基因重组。
• 真核微生物基因重组 有性杂交 准性杂交（异核体、杂合双倍体、重组
双倍体、重组单倍体）
转化(transformation)
选用最适剂量
剂量:诱变剂浓度和处理时间 合适剂量：扩大变异幅度
促使变异移向正变范围
利用复合处理的协同效应
两种或多种诱变剂先后使用 两种或多种诱变剂同时使用 同种诱变剂重复使用
设计高效筛选方案或方法
第一轮
一个出诱变剂 发菌株 处理
选出200个 菌株
初筛
复筛
选出50株
选出5 株
（每株1瓶）
（每株4瓶）
缺少一个碱基 ABC BCA BCA BCA BCA BCA BCA BCA
ＤＮＡ分子中缺失或增加少数几个碱基对引起
染色体畸变
UV
嘧啶
嘧啶二聚体
光复活作用:
光解酶 嘧啶二聚体
嘧啶
诱变育种的基本环节
大多死亡
出发菌株
多数未变
诱变
少数存活
多数负变
少数突变
少数正变
多数幅度小 多数不宜投产
少数幅度大
少数适宜投产
细菌域
微生物的范围
古生菌域
真核生物域
生命三域
第二章 微生物的菌种选育
AC
T GA
A
AA C T TG
CA
C
G TAG
内容提要
遗传变异的物质基础 基因突变 微生物的基因重组 微生物的菌种选育 菌种的衰退复壮和保藏
遗传变异的物质基础
物核 质酸 的是 证遗 明传
动物实验
转化实验
材料 细菌培养实验 方法 无细胞抽提液试验
噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验
遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式
实验材料： 肺炎双球菌
光滑型（S）
有荚膜 菌落光滑 分泌毒素 致病
SⅠSⅡSⅢ三个血清型
粗糙型（R）
无荚膜 菌落粗糙 无毒 不致病
RⅠRⅡRⅢ三个血清型
转化实验（1）动物实验 活
加活R菌或死S菌
加活S菌
死
加活R菌和热死S菌
死
营养缺陷型
基本培养基
影印接种法
影印接种
完全培养基 营养缺陷型
基本培养基
限量补充培养法
微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株
菌丝过滤法
筛选营养突变株
菌丝过滤得 营养突变株
培养
长出菌丝体 （野生型）
基本培养基
接入微生物孢子
（含营养突变株）
涂布均匀
微生物的基因重组
腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T） 胞嘧啶（C）
DNA
DNA就是脱氧核糖核酸（长链）
腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T） 胞嘧啶（C）
AC
AA C C A C
T GA A T TG G T AG
基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G…...
复制（reproduce）
转录（transcription）
NUCLEOPLASM