菊花转录因子基因DgNAC1的过表达提高了菊花的耐盐性

菊花转录因子基因DgNAC1的过表达提高了菊花的耐盐性摘要：NAC转录因子在抵抗不同的非生物胁迫中发挥有效作用，并且已经证明拟南芥中NAC TF的过量表达有助于改善耐盐性。

然而，菊花中NAC基因的功能仍然不甚了解。

在这里，我们进行生理学和分子实验来评估DgNAC1在菊花盐胁迫反应中的作用。

在本研究中，DgNAC1-过表达的菊花比WT（野生型）上显然更耐盐。

具体来说，转基因菊花在盐胁迫下显示出比WT更高的存活率和更低的EC（电解质电导率）。

转基因菊花的MDA（丙二醛）和活性氧（H2O2和O2-）的积累量较少，SOD（超氧化物歧化酶），POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）活性更高，脯氨酸含量高于WT 在盐胁迫下。

此外，转基因菊花中的胁迫响应基因在盐胁迫下比WT更显着上调。

因此，所有结果表明，DgNAC1作为盐胁迫响应的正调节因子，可能是耐盐植物分子育种的必需基因。

介绍：盐度，干旱，寒冷和高温是植物在其本土环境中生长时常常易受伤害的主要非生物胁迫。

高盐度是植物生长，发展，生产力和质量的重要环境压力。

因此，为了对抗盐度胁迫，植物已经发展了许多策略，包括分子反应和复杂的生理和生化反应。

一般来说，植物通过改变与生物化学，生理学和转录激活相关的许多应激相关基因的表达来响应和适应非生物胁迫。

到目前为止，已经确定了许多盐反应基因。

其中，AP2 / EREBP，WRKY，NAC，bHLH和bZIP等转录因子（TFs）已被证明在保护植物免受各种非生物胁迫和通过调节应激反应基因建立胁迫耐受力方面发挥关键作用。

NAC（矮牵牛NAM和拟南芥ATF1 / 2和CUC）转录因子（TFs）包含转录因子中最大的转录因子之一，其在N末端区共享高度保守的结构域，被定义为NAC 结构域。

在拟南芥和水稻中分别鉴定了约105和75个NAC基因。

据报道，NAC TF 参与了大量的过程，如器官形成，植物生长，激素平衡，衰老和抗非生物或生物胁迫。

例如，在小麦中，TaNAC2参与了对盐，干旱和脱落酸处理的反应，TaNAC2的过表达提高了拟南芥中盐，干旱，冻害胁迫的耐受性。

然而，NAC基因在菊花对环境胁迫反应中的作用尚不清楚。

菊花是世界上主要的观赏植物之一，为其切割种植而成，其生产受到非生物胁迫的一系列威胁的极大影响。

为了提高菊花耐盐性，我们从菊花中分离出了一种名为DgNAC1的NAC转录因子基因，其功能已经在烟草中得到验证。

结果表明，DgNAC1是由盐，干旱，冷和ABA（脱落酸）处理诱导的，DgNAC1过表达的烟草比WT具有更高的耐盐性。

本研究中属于ATAF亚组蛋白质的DgNAC1在菊花品种“金巴”中过表达，以进一步探讨DgNAC1对盐胁迫的作用。

从应激测定，DgNAC1的过表达提高了菊花的盐度耐受性，通过正调节胁迫相关基因，赋予植物更好的渗透调节和膜保护机制。

方法生成DgNAC1转基因株系先前分离了盐胁迫响应性NAC基因DgNAC1。

为了在菊花（品种“金巴”）中过表达DgNAC1，通过置换gus基因，将DgNAC1的全长cDNA插入到CaMV 35S 启动子控制下的pBI121（Clotech）中。

将获得的载体通过根癌土壤杆菌转化到菊花叶片中，通过qRT-PCR测定得到的11条线中DgNAC1的表达水平，然后选择三条线（OE- 3，OE-9和OE-11），其后续实验表现出相对较高的表达。

植物材料和耐盐性评估对于本实验，三株转基因株系和野生菊金巴种植在泥炭和珍珠岩1:1混合物的盆中，并在23±2℃，12小时光周期，70％相对湿度的条件下在光培养箱中生长。

在6-7叶阶段对类似的一组幼苗进行盐胁迫耐受性，其中在4天保留水后，随着NaCl浓度的增加，植物每隔一天灌溉至土壤容积：第1-5天100mM，第5-10天为200mM，在第10-15天为400mM。

在特定的时间点，即在盐处理后0,1,5,10,15天收获的中等叶（来自植物的顶部的叶4-5）用于实验测试。

每次测定进行三次重复，然后测量平均值。

15天后，从土壤中除去转基因株系和WT; 将根用去离子水漂洗，然后重新放入新鲜土壤中回收2周。

精确计算菊花的存活率。

测量EC和MDA含量将菊花幼苗暴露于盐胁迫条件下，收集中间叶（植物顶部4-5叶），以便在不同时间点进行测量。

按照Xing等人描述的方法测量菊花叶中的EC。

将菊花叶用蒸馏去离子水冲洗，并置于10ml蒸馏水中，在室温下摇动（300rpm）4小时。

初始电导率（C1）需要用电导率计来确定。

将样品煮沸20分钟以诱发最大泄漏，然后在室温下冷却后测量电解质电导率（C2）。

最后，基于100％×C1 / C2计算EC的百分比。

张氏等方法测定菊花叶中的MDA含量。

（2009年）。

将0.5g叶子在5ml 10％TCA（三氯乙酸）溶液中匀浆并离心。

在10％TCA中将2ml叶提取物上清液加入到0.6％TBA（硫代巴比妥酸）中。

将混合物在沸水中孵育15分钟，然后在冰浴中冷却。

将样品离心，并通过监测450,532和600nm处的吸光度来测量MDA含量。

测量GSH（谷胱甘肽），脯氨酸和抗氧化酶的活性在盐胁迫下，在第0,1,5,10和15天，对对照和转基因菊花的第四和第四叶进行取样，并用于生化分析。

按照Zhang和Kirkham的方法测量GSH，并按照Irigoyen等人的方法测量脯氨酸含量。

按照Beauchamp和Fridovich的方法测量SOD活性; 按照Ranieri等人的方法测量POD活性。

并按照Zhang等人的方法测定CAT活性。

H2O2（过氧化氢）和O2-（超氧阴离子）的原位组织化学定位使用相应的检测试剂盒对菊花叶片的H2O2和O2-含量进行定量分析。

0.5g 叶片用0.1％TCA研磨，并在4℃以10,000g离心20分钟。

上清液用于测量H2O2。

反应混合物由0.5ml提取的上清液，0.5ml K 2 PO 4 Bu和2ml 1M KI试剂组成。

将反应在黑暗中显影1小时，并在390nm测量吸光度。

对于O 2测量，在4℃下将0.5g叶子用2ml 50mM磷酸盐沉淀（pH 7.8）研磨。

匀浆通过四层干酪包布，并以5000g离心10分钟。

混合1ml上清液，0.9ml磷酸盐（pH 7.8）和1ml 10mM 羟胺，并在25℃温育20分钟。

然后加入0.5ml 17mM对氨基苯磺酸和0.5ml 7mM α-将萘胺加入到上述培养溶液中，并将混合物在25℃下孵育20分钟。

孵育后，液体变色，加入等体积的乙醚。

将混合物搅拌并以1500g离心5分钟，然后在530nm测量粉红色层的吸光度。

另外，根据Shi等人，分别根据DAB（二氨基联苯胺）和NBT（硝基蓝四唑）的组织化学染色检测了H2O2和O2-的积累。

（2010年）。

对于H 2 O 2检测，将来自转基因菊花和WT的叶子浸入在10mM磷酸盐（pH 7.8）中制备的1mg ml-1新鲜DAB溶液（pH 3.8）中，直到观察到棕色斑点。

对于O2-检测，将样品置于10mM磷酸盐（pH 7.8）中制备的1mg ml-1新鲜NBT溶液中，并在浅色下直至出现蓝点。

然后将染色的叶子在浓缩的乙醇中漂白并保存在70％乙醇中，然后再拍照。

用于分析基因表达的qRT-PCR并使用EF1a（伸长因子1a）基因作为参照结果DgNAC1的表达在11个转化体系中，使用三个独立的转基因株系（OE-3，OE-9和OE-11）和WT来通过qRT-PCR来确定DgNAC1的转录水平。

qRT-PCR实验显示，在OE-3，OE-9和OE-11系中DgNAC1的表达显着高于WT（P <0.05）。

DgNAC1的过表达增强了对盐胁迫的耐受性在转基因菊花和WT之间比较盐胁迫耐受性，并且在温室中培养两种转基因品系和WT。

在正常条件下，在转基因菊花和WT之间的所有生命周期中，表型没有任何差异（图2c）。

对于耐盐性测定，WT菊花的枯萎过程比转基因菊花的萎缩过程快，NaCl溶液浓度逐渐增加（图2a，c）。

盐胁迫恢复2周后，三株转基因品系的存活率（OE-3，OE-9和OE-11）分别为95.07,92.60和88.90％，而WT仅为59.23％（图2b）。

这些结果表明，DgNAC1在营养生长过程中赋予转基因菊花更高的耐盐性。

转基因株系和WT在盐胁迫下EC，MDA和脯氨酸的积累转基因株系的EC在非胁迫条件下与WT的EC无明显不同。

随着胁迫时间的延长，转基因品系和WT均呈现缓慢增长的趋势。

然而，在盐处理下，在第1天至第15天，OE-3，OE-9和OE-11比在WT中显着降低（P <0.05）。

例如，5天时，三只转基因株系的EC分别比第0天增加了16.19％，9.54％和11.72％，而WT的EC增加了34.48％; 15天时，转基因株系的EC分别比第0天增加了22.27,18.32和19.92％，WT增加了55.94％（图3a）。

这些结果表明，三种转基因株系均由较不严重的膜损伤引起，表现出较高的耐盐性。

在正常生长条件下，MDA含量在所有品系中相似。

然而，在压力发作的后期，MDA在相对于WT的转基因品系中显示出与EC相似的趋势，显着（P <0.05）更低（图3b）。

盐处理15天，转基因菊花中的MDA分别比第1天分别提高约1.94- 1.93-和2.06倍，而WT中的MDA分别增加了2.4倍。

这些结果表明，DgNAC1的过表达赋予了盐胁迫诱发的氧化应激的更大耐受性。

在对照条件下，转基因菊花和WT之间的脯氨酸含量没有明显的差异。

然而，随着盐处理时间的延长，在整个处理期间，所有品系中的脯氨酸含量迅速增加，转基因株系的脯氨酸含量高于WT植物（图3c）。

到第15天，三个转基因品系中脯氨酸含量的累积分别比第0天增加了23.85倍，24.45倍和25.33倍，而WT 仅增加了15.09倍。

这些结果表明，DgNAC1可能在盐胁迫下转基因菊花中的脯氨酸水平正相关。

在盐胁迫下转基因菊花和WT中H2O2和O2-的积累过量的ROS（活性氧）的积累是导致膜损伤的关键因素。

转基因菊花中MDA 含量较低迫使我们检查在盐度胁迫下测试的线的H2O2和O2-，两个主要的活性氧的积累。

因此，使用检测试剂盒在几个不同的处理时间定量分析了所有品系叶中的H2O2和O2-的含量。

盐度处理后，三株转基因株系的H2O2和O2-水平显着高于对照（P <0.05）WT（图4a，b）。

更具体地说，盐胁迫第十五天转基因株系叶片的H2O2分别分别为WT的74.2％，75.6％和72.4％。

在盐胁迫第十五天，转基因株系叶片的O2-水平分别为WT中的70.9％，71.1％，70.7％。

为了进一步确定定量测量，用盐酸处理0,1,5,10,15天的转基因和WT菊花叶用DAB和NBT染色，分别显示H 2 O 2和O 2 - 的原位积累。