分子生物学PBL-基因表达检测_图文.ppt
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基因表达的检测PPT课件
2) 选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结构 的蛋白质，即通过Mrnau前性的选择性拼接而产生不 同的成熟mRNA，然后翻译成不同的蛋白质。
3) 选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细 胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性 的表达。
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3. RNA编辑的调控： RNA编辑（editing）：是指转录后的mRNA前体在编码区发生 核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：
▪ 转录起始的调控：
基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶 的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用 等。
– 反式作用因子的活性调节： • 表达调节：迅速合成、迅速降解
• 共价修饰：磷酸化－去磷酸化、糖基化
• 配体结合：激素－激素受体（是核内的反式作用因子）
➢ 亮氨酸拉链（leucine zipper）
➢ 螺旋－转角－螺旋（helix-loop-helix）
4) RNA聚合酶对基因表达的影响： A. 转录起始是通过RNA聚合酶与启动子的结合来实现的，转录起始的调控 是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。 B. 不同启动子的序列不同，因而影响它们与RNA聚合酶结合的亲和力， 亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。 C. RNA聚合酶和启动子的结合也会受到调节蛋白的影响,阻遏蛋白、激活蛋
5. 基因重排：
基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基 因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的 以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编 码区的连接： – 一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。
3) 选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细 胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性 的表达。
当前您正浏览第十八页，共七十四页。
3. RNA编辑的调控： RNA编辑（editing）：是指转录后的mRNA前体在编码区发生 核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：
▪ 转录起始的调控：
基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶 的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用 等。
– 反式作用因子的活性调节： • 表达调节：迅速合成、迅速降解
• 共价修饰：磷酸化－去磷酸化、糖基化
• 配体结合：激素－激素受体（是核内的反式作用因子）
➢ 亮氨酸拉链（leucine zipper）
➢ 螺旋－转角－螺旋（helix-loop-helix）
4) RNA聚合酶对基因表达的影响： A. 转录起始是通过RNA聚合酶与启动子的结合来实现的，转录起始的调控 是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。 B. 不同启动子的序列不同，因而影响它们与RNA聚合酶结合的亲和力， 亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。 C. RNA聚合酶和启动子的结合也会受到调节蛋白的影响,阻遏蛋白、激活蛋
5. 基因重排：
基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基 因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的 以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编 码区的连接： – 一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。
基因表达_3 PPT
信 宜 华
凌 通
侨制
中 学
作
小结
新名词：
转运RNA（ mRNA ）信使RNA（ tRNA）
重要概念：
基因、遗传信息、转录、翻译、密码子、 性状
重要生理过程：
转录、翻译
信 宜 华
凌 通
侨制
规律总结： 非常讲解P19-说明：
中 学
作
练习题
非常讲解
P29-3、 P304、6、9、10、15 P128-6
信 宜 华
凌 通
侨制
中 学
作
翻译：是指以mRNA为模板，按照碱基
互补配对原则，合成特定蛋白质的过程。
信 宜 华
凌 通
侨制
中 学
作
密码子：遗传学上把mRNA上决定一个
氨基酸的三个相邻的碱基，叫做一个密 码子。（含起始码、终止码）
密码子
密码子
密码子
U U A G AU AUC
信 宜 华
凌 通
侨制
中 学
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湘雅分子生物学PBL
空白管 150μ l 2.85ml －
测定管 145μ l 2.85ml 5μ l
摇匀，室温放置 5 分钟，空白调零，于 595nm 处比色
• 绘制标准曲线，计算测定管的浓度
3.制SDS-PAGE胶
装配好制胶玻璃板
↓
配制12％的分离胶，再加入APS和TEMED
↓
将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下 1cm,操作中注意防止产生气泡， 聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液
基本原理
• 所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白 发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），较难大量获 得该抗体，使得对其进行标记很困难。能与一抗结合的抗体，为第 二抗体（简称二抗）。二抗将一抗的FC段作为抗原，而每一物种的 抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而 对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异 性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行，检测便可检出靶蛋 白。
10×TBS（Tris buffer solution）, pH7.6；TBS-T，pH7.6；5×电泳缓 冲液，pH8.3；转移缓冲液（25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20％甲 醇），pH8.3；10mM PMSF液；裂解缓冲液；PBS；10％过硫酸胺 （APS）；1％溴酚蓝；30%丙烯酰胺；Sample Buffer（上样缓冲液）
NC膜
7.封闭NC膜
转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分 钟。
↓ 用western blotting封闭液封闭NC膜， 室温下振荡1小时后4℃过夜（NC膜正面向上）
8.一抗结合
一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(β-actin)配制） ↓ 室温振摇2小时（NC膜正面向上） ↓ 以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟
生化pbl PPT课件
基因 拷贝数的变化
酶切DNA样品上样
重物
DNA印迹
电泳
转移
杂交，显影
Northern 印迹和RT-PCR可用于 分析基因转录水平的变化
• Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上， 定性分析mRNA的常用方法； • RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA 为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种 方法； • 二者均可用于分析基因转录水平的变化 。
二、PCR技术可以进行实时、 定量分析
荧光标记引物
3'
R
Q
5'
上游 引物
5'
下游 3' 引物
R
3' 5'
Q
5' 3'
15
2、HIV的抗体检测
酶联免疫吸附试验（ELISA） 颗粒凝集试验(PA） 金标快速反应试剂(rapid test，RT)
酶联法（ELISA）
酶联法即酶联免疫吸附试验是检测艾滋病的一种固相免疫 测定技术,其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,并 保持其免疫活性。这种方法简称ELISA。
HIV核酸的定量检测
• • • • 1.RT-PCR 2核酸序列扩增实验(NASBA) 3.分枝DNA信号扩大系统(bDNA) 4荧光实时PCR
聚合酶链式反应（PCR）
• 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） – 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； – 可用于分析基因及其产物的水平变化； – 可进行实时、定量分析； – 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列 的相互作用。
AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 S1 核酸酶
酶切DNA样品上样
重物
DNA印迹
电泳
转移
杂交，显影
Northern 印迹和RT-PCR可用于 分析基因转录水平的变化
• Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上， 定性分析mRNA的常用方法； • RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA 为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种 方法； • 二者均可用于分析基因转录水平的变化 。
二、PCR技术可以进行实时、 定量分析
荧光标记引物
3'
R
Q
5'
上游 引物
5'
下游 3' 引物
R
3' 5'
Q
5' 3'
15
2、HIV的抗体检测
酶联免疫吸附试验（ELISA） 颗粒凝集试验(PA） 金标快速反应试剂(rapid test，RT)
酶联法（ELISA）
酶联法即酶联免疫吸附试验是检测艾滋病的一种固相免疫 测定技术,其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,并 保持其免疫活性。这种方法简称ELISA。
HIV核酸的定量检测
• • • • 1.RT-PCR 2核酸序列扩增实验(NASBA) 3.分枝DNA信号扩大系统(bDNA) 4荧光实时PCR
聚合酶链式反应（PCR）
• 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） – 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； – 可用于分析基因及其产物的水平变化； – 可进行实时、定量分析； – 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列 的相互作用。
AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 S1 核酸酶
基因表达教学课件ppt
翻译是将基因中的遗传信息转变成蛋白质的过程，是基因表达的重要环节之 一。
翻译的场所
翻译主要在细胞质的核糖体上进行，核糖体是由RNA和蛋白质组成的复合体 。
翻译的起始
起始密码子
翻译的起始信号是mRNA上的起始密码子，它与核糖体上的起始因子结合，起始 翻译过程。
起始因子的作用
起始因子与起始密码子结合后，可以促进核糖体与mRNA的结合，并启动翻译过 程。
02
基因表达研究在农业领域也得到了广泛应用，通过对植物和动物基因表达的研 究，可以更好地了解生长发育和适应环境的机制，提高生产效率。
03
基因表达研究在环境科学领域也扮演着重要的角色，通过对不同生物在相同环 境下的基因表达比较，可以更好地了解生物对环境的适应性，为环境保护提供 科学依据。
基因表达研究的发展趋势
02
基因表达的转录
转录的概述
01
02
03
定义
转录是指将DNA序列转 化为RNA序列的过程。
转录的酶
转录需要RNA聚合酶的 参与。
转录的场所
转录主要发生在细胞核内 。
转录的启动
启动子
转录的启动子是RNA聚合酶识别和结合DNA序列的位点。
转录起始复合物
启动子与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。
转录起始复合物的形成过程
基因表达谱
通过基因表达谱可以了解疾病状态下哪些基因在发生变化，从而 为疾病的诊断提供依据。
生物标志物
一些基因表达产物可以作为疾病的生物标志物，例如：前列腺癌 中的PSA基因。
疾病分型
基因表达数据可以用于疾病的分型，例如：肺癌可以分为鳞状细 胞癌、腺癌和小细胞肺癌。
基因表达异常与疾病的治疗
靶向治疗
翻译的场所
翻译主要在细胞质的核糖体上进行，核糖体是由RNA和蛋白质组成的复合体 。
翻译的起始
起始密码子
翻译的起始信号是mRNA上的起始密码子，它与核糖体上的起始因子结合，起始 翻译过程。
起始因子的作用
起始因子与起始密码子结合后，可以促进核糖体与mRNA的结合，并启动翻译过 程。
02
基因表达研究在农业领域也得到了广泛应用，通过对植物和动物基因表达的研 究，可以更好地了解生长发育和适应环境的机制，提高生产效率。
03
基因表达研究在环境科学领域也扮演着重要的角色，通过对不同生物在相同环 境下的基因表达比较，可以更好地了解生物对环境的适应性，为环境保护提供 科学依据。
基因表达研究的发展趋势
02
基因表达的转录
转录的概述
01
02
03
定义
转录是指将DNA序列转 化为RNA序列的过程。
转录的酶
转录需要RNA聚合酶的 参与。
转录的场所
转录主要发生在细胞核内 。
转录的启动
启动子
转录的启动子是RNA聚合酶识别和结合DNA序列的位点。
转录起始复合物
启动子与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。
转录起始复合物的形成过程
基因表达谱
通过基因表达谱可以了解疾病状态下哪些基因在发生变化，从而 为疾病的诊断提供依据。
生物标志物
一些基因表达产物可以作为疾病的生物标志物，例如：前列腺癌 中的PSA基因。
疾病分型
基因表达数据可以用于疾病的分型，例如：肺癌可以分为鳞状细 胞癌、腺癌和小细胞肺癌。
基因表达异常与疾病的治疗
靶向治疗
基因表达和检测 PPT
子； – "转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增； – "选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而 分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进 行"外科手术"。
kanr, neor） 5．琥珀突变抑制基因 supF
amp R
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
筛选标记基因
筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到 一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。
1．插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
染色体与质粒
• 存在于染色体外（细菌的DNA除大部分集中于核质内） • 双链环形DNA • 分子量远比染色体为小，仅为细菌染色体DNA的0.5～3% • 质粒亦可携带遗传信息，可决定细菌的一些生物学特性 • 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质 • 质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身
因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插 入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
2．α-互补（α-complementation）
amp R
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
原核表达系统的重要调控元件： • 启动子 • SD序列 • 终止子
基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而 分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进 行"外科手术"。
kanr, neor） 5．琥珀突变抑制基因 supF
amp R
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
筛选标记基因
筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到 一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。
1．插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
染色体与质粒
• 存在于染色体外（细菌的DNA除大部分集中于核质内） • 双链环形DNA • 分子量远比染色体为小，仅为细菌染色体DNA的0.5～3% • 质粒亦可携带遗传信息，可决定细菌的一些生物学特性 • 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质 • 质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身
因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插 入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
2．α-互补（α-complementation）
amp R
选择性：选择标记基因和筛选标记基因
原核表达系统的重要调控元件： • 启动子 • SD序列 • 终止子
医学分子生物学基因结构与表达分析方法(共93张PPT)
第四十一页，共93页。
PCR thermal cycler
第四十二页，共93页。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1000bp
900bp
800bp 700bp
600bp
500bp 400bp
300bp
200bp
Marker
第四十三页，共93页。
PCR产物
5. 平台期与平台效应 PCR经过一定数量的循环后，DNA
第三十九页，共93页。
25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。
激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子， 一对引物：正向和反向
限制了PCR扩增的片段的范围 应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。
发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集，计算机分析与DNA自动排序
第十五页，共93页。
第二十三页，共93页。
第二十四页，共93页。
四、斑点杂交
优点：简单、迅速 可在同一张膜上进行多个样品的检测 核酸粗提样品的检测效果也较好
第二十五页，共93页。
五、原位杂交in situ hybridization
用于核酸定性、定位分析。 菌落原位杂交
荧光原位杂交
第二十六页，共93页。
核酸杂交分类表
医学分子生物学基因结构与表 达分析方法
第一页，共93页。
第一节 DNA序列分析
一、双脱氧末端终止法
二、化学降解法 三、DNA自动化序列分析 四、新一代DNA测序分析
第二页，共93页。
一、双脱氧末端终止法
DNA合成反应
第三页，共93页。
ATP、dATP和ddATP的结构
第四页，共93页。
第五页，共93页。
PCR thermal cycler
第四十二页，共93页。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1000bp
900bp
800bp 700bp
600bp
500bp 400bp
300bp
200bp
Marker
第四十三页，共93页。
PCR产物
5. 平台期与平台效应 PCR经过一定数量的循环后，DNA
第三十九页，共93页。
25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。
激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子， 一对引物：正向和反向
限制了PCR扩增的片段的范围 应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。
发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集，计算机分析与DNA自动排序
第十五页，共93页。
第二十三页，共93页。
第二十四页，共93页。
四、斑点杂交
优点：简单、迅速 可在同一张膜上进行多个样品的检测 核酸粗提样品的检测效果也较好
第二十五页，共93页。
五、原位杂交in situ hybridization
用于核酸定性、定位分析。 菌落原位杂交
荧光原位杂交
第二十六页，共93页。
核酸杂交分类表
医学分子生物学基因结构与表 达分析方法
第一页，共93页。
第一节 DNA序列分析
一、双脱氧末端终止法
二、化学降解法 三、DNA自动化序列分析 四、新一代DNA测序分析
第二页，共93页。
一、双脱氧末端终止法
DNA合成反应
第三页，共93页。
ATP、dATP和ddATP的结构
第四页，共93页。
第五页，共93页。
动态突变——PBLPPT课件
• 动态突变所引起的疾病可有早现和性别差异的特点
.
2
CATALOGUE
1
动态突变的机制
2
动态突变的致病机制
3
动态突变的主要相关疾病
.
3
动态突变的机制
.
4
动态突变的机制
• 重复片段的扩增与DN A复制过程中的错误有关 “链滑”机制
• DNA复制时,以含有重复序列的DNA单链为模板合成的新链可以由于链
.
12
Huntington 舞蹈病 (HD)
Hunting to n舞蹈病与位于染色体4p16. 3 的IT15基因有关。 • IT15基因在第一个外显子的起始密码子ATG下游处有一段多态性的三核苷酸
CAG的重复序列,转录并翻译产生一段多聚谷氨酰胺( po lyQ)连于Hunting ton蛋 白的N端。 • 正常人的CAG重复数9～ 34次, HD患者大于36次。
滑作用造成碱基错配,
• 如果错配引起新生链上形成泡状或发卡等单链结构,则造成重复片段的
扩增，反之如促使母链形成泡状或发卡结构,也可以导致新生链的缺失。
• 多余环状或发卡结构或者随后被核酸酶切除而修复,或者在错配修复缺
陷等情况下未被切割修复而保留在新生链中,从而产生重复序列拷贝数
的扩增。
• 冈崎片段的合成过程与链滑的产生可能有关。
响细胞的正常功能; • HD病人的神经元中发现一种含有Huntington N 端片段的蛋白聚集体, 抑制它
的形成可延缓HD的进展，但并不确定。
.
14
其他
RNA 毒性蓄 积
核苷酸重复 序列异常扩
增
强直性肌营养不良( DM)
致病基因位于19q13. 3，正常人CTG 拷贝数为5～ 37个DM患者可达数百个 至数千个。( CTG) n能被转录, 影响基 因的表达,从而出现DM1症状。
.
2
CATALOGUE
1
动态突变的机制
2
动态突变的致病机制
3
动态突变的主要相关疾病
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3
动态突变的机制
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4
动态突变的机制
• 重复片段的扩增与DN A复制过程中的错误有关 “链滑”机制
• DNA复制时,以含有重复序列的DNA单链为模板合成的新链可以由于链
.
12
Huntington 舞蹈病 (HD)
Hunting to n舞蹈病与位于染色体4p16. 3 的IT15基因有关。 • IT15基因在第一个外显子的起始密码子ATG下游处有一段多态性的三核苷酸
CAG的重复序列,转录并翻译产生一段多聚谷氨酰胺( po lyQ)连于Hunting ton蛋 白的N端。 • 正常人的CAG重复数9～ 34次, HD患者大于36次。
滑作用造成碱基错配,
• 如果错配引起新生链上形成泡状或发卡等单链结构,则造成重复片段的
扩增，反之如促使母链形成泡状或发卡结构,也可以导致新生链的缺失。
• 多余环状或发卡结构或者随后被核酸酶切除而修复,或者在错配修复缺
陷等情况下未被切割修复而保留在新生链中,从而产生重复序列拷贝数
的扩增。
• 冈崎片段的合成过程与链滑的产生可能有关。
响细胞的正常功能; • HD病人的神经元中发现一种含有Huntington N 端片段的蛋白聚集体, 抑制它
的形成可延缓HD的进展，但并不确定。
.
14
其他
RNA 毒性蓄 积
核苷酸重复 序列异常扩
增
强直性肌营养不良( DM)
致病基因位于19q13. 3，正常人CTG 拷贝数为5～ 37个DM患者可达数百个 至数千个。( CTG) n能被转录, 影响基 因的表达,从而出现DM1症状。