土壤中分解尿素细菌的分离和计数
“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的教学设计与实施-
“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的教学设计与实施1教材分析与课时安排“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”是人教版高中生物（选修1）专题2“微生物的培养与应用”的第二个课题，学生已学习了有关培养基和无菌技术的基本知识，在掌握使用平板划线法和稀释涂布法、分离和纯化微生物的实验操作的基础上，研究培养基对微生物的选择作用，并测定其数量。
其中既有关于特定菌株的选择策略等知识性内容，又有土壤溶液的稀释、菌落数量统计等操作性内容，难度较大、探究性较强，是培养学生设计实验、动手操作等科学探究能力，提高生物科学素养的好素材。
本课题教学实施中的关键在于两点：①教师要处理好知识性内容与操作性内容的关系，要让学生理解特定菌株的选择策略，并学习有关的实验方法和操作程序;②处理好课常与课后的关系。
本课题的实验操作时间不长，但是操作前要制备培养基、对培养基和其他操作用具进行灭菌，操作后的培养时间和对微生物进行观察则需要较长时间，因此需要教师精心设计教学程序，统筹安排教学时间。
根据这一教材特点，本课题教学可分2个课时进行，2个课时之间应留有2 d左右的间隔，以便进行微生物的培养与观察。
2教学目标2.1知识目标简述稀释涂布平板法分离微生物和进行微生物计数的实验原理;说出选择性培养基和鉴别性培养基的用途;归纳分离纯化微生物的原理和方法。
2.2能力目标学会制备土壤样本稀释液，学会用稀释涂布法将菌样液接种到固体培养基平板;学会用稀释涂布平板法进行微生物数量测定的方法。
2.3情感、态度与价值观目标体验科学知识的形成过程，加深对科学本质的理解;体会在实验活动中合作学习的有效性，养成严谨的科学态度。
3教学准备3.1土壤样品的采集以及土壤溶液的配制为保证实验取得预期效果，应选择经常施用尿素的农田，铲去表土后采集3～8 cm深度范围内的土壤;回实验室后，去除土壤中的植物枯枝败叶及其他杂物，用托盘天平称取样品10 g，加入到盛有90g无菌水的锥形瓶中，震荡10min，即制得101土壤溶液;制备完成后可置于冰箱冷藏室内备用（1～2 d）。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)一、研究背景和意义土壤中的细菌群落对于土壤生态系统的基本功能起着至关重要的作用。
其中，土壤微生物的代表——细菌在土壤有机质的分解中是不可或缺的，其中包括尿素的分解。
尿素是一种有机氮化合物，很多植物都会把尿素当作氮素的主要来源。
但是，尿素很容易被细菌分解成为氨气，因此，如果过量的尿素进入土壤，细菌可能会分解尿素而产生氨气，而氨气毒性较强，可能对于周围的生态产生较大的负面影响。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，有助于深入了解尿素分解的生态机理，从而为保护土壤生态环境提供理论基础和技术支持。
二、实验目的1.利用培养基筛选土壤中分解尿素的细菌，并分离单种菌株。
2.利用计数法确定土壤中分解尿素的细菌群落的数量。
3.了解土壤中分解尿素的细菌群落的形态特征和特点。
三、实验步骤1.尿素培养基制备:将1000ml蒸馏水与20g尿素、0.5g葡萄糖、0.1g磷酸氢二钾、0.2g酵母提取物、0.1g镁硫酸钾、0.5g氯化钠、0.5g硫酸铵、15g琼脂、适量pH指示剂溶解在一起，灭菌后即可得到尿素培养基。
2.样品制备：取10g土壤样品加入稀溶液后混合均匀，再经过过滤器过滤掉大颗粒，得到土壤浸液样品。
3.单种菌株筛选：将土壤浸液样品接种到尿素培养基中，在28℃下培养2-3天。
筛选到单种菌株后，通过高倍显微镜观察菌落的形态和特点，然后进行相应的鉴定。
4.计数法：将稀溶液进行逐步稀释，然后取稀释液的适量体积接种在尿素培养基上，在28℃下培养2-3天，根据菌落数确定土壤中细菌的数量。
四、实验结果及分析通过尿素培养基的筛选，共分离出5种分解尿素的细菌，并进行了表征与鉴定。
通过计数法，成功地计算出了土壤中的分解尿素的细菌数量。
土壤中分解尿素的细菌群落种类多样，数量较多，这对于土壤中尿素分解的生态机理研究具有重要的意义。
同时，该实验的操作简单，成本低廉，适用于在实验室环境下大规模进行。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课堂合作探究
问题导学
一、研究思路
活动与探究 1 1.寻找目的菌株的思路是什么? 提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。
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2.阅读教材第 22 页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问 题。
(1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 什么物质?琼脂的作用是什么?
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•9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。2021/9/172021/9/17Friday, September 17, 2021 •10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。2021/9/172021/9/172021/9/179/17/2021 11:29:17 PM •11、只有让学生不把全部时间都用在学习上，而留下许多自由支配的时间，他才能顺利地学习……（这）是教育过程的逻辑。2021/9/172021/9/172021/9/17Sep-2117-Sep-21 •12、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。2021/9/172021/9/172021/9/17Friday, September 17, 2021
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迁移与应用 1 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍 数为 106 的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是( )。 A.涂布了一个平板,统计的菌落数是 230 B.涂布了两个平板,统计的菌落数是 215 和 260,取平均值 238 C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 21、212 和 256,取平均值 163 D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 210、240 和 250,取平均 值 233
完整版：土壤中分解尿素细菌分离与计数
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30— —300的平板，则说明稀释操作比较成功， 并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数 的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不 精确，需要重新实验。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进 行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
这个实例可以看出，实验结果要有说服力， 对照的设置是必不可少
二、实验设计
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样
“微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%—90%是细菌
鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 1、酚红培养基：
鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶 阳性 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红—美蓝结 合→ 菌落呈深紫色并带有金属光泽。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去 表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。
（二）制备培养基 制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ （对照作用）
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落 数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋 白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起 到了选择作用。
人教版生物选修一第二章第二节-土壤中分解尿素细菌的分离与计数
2、实验室中目的菌株的筛选 （1）原理：人为提供有利于目的菌株__生__长___的__条__件__，同时 __抑__制__或___阻__止___其他微生物生长。例如，加高盐，青霉素等条件。 （2）方法：利用_选___择__培养基。 概念：允许__特__定__种__类___的微生物生长，同时抑制或阻止其他种
√D.培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子
2．下表是某培养基的配方，有关叙述正确的是（ ）
MgSO4·
成分 NaNO3 K2HPO4 FeSO4
琼脂 葡萄糖 H2O 青霉素
7H2O
100 0.1万
含量 3g
1g
0.01g 0.5g 15g 30g
mL 单位
A．葡萄糖能为微生物提供碳源，该微生物为自养型微生物
2、三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀 释倍数为106的培养基中，涂布时的体积为0.1ml，得到以下两种统计结果。 ①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 ②乙同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、 212和 256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 ③丙同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为235、 236和 237，该同学以这三个平板上菌落数的平均值236作为统计结果。 你认为哪位同学的结果更接近真实值？其他的为什么不行？
第二章 微生物的培养与应用 第2节 土壤中分解尿素细菌的分离与计数
一、课题背景
尿素[CO（NH2）2]是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不能 直接被农作物吸收。
只有当土壤中的细菌将尿素分解成_氨___之后，才能被植物利用。 土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成__脲__酶____。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数作业
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。
据图分析正确的是( )A．3号试管的稀释倍数为103倍B．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个C．5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为4号试管的10倍D．该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数2、下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4．7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4．7H2O、葡萄糖、琼脂、水C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4．7H2O、尿素、琼脂、水D. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4．7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水3、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验示意图。
据图分析下列叙述正确的是( )A.3号试管中样品的稀释倍数为103倍B.用4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数约为5号试管的10倍C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高4、如图为纤维单胞菌（能产生纤维素酶）的获取过程。
下列有关叙述错误的是( )A.①②③④培养基都应以纤维素为唯一碳源B.图中所用培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法C.④所用的接种方法可对培养的微生物进行计数D.可用刚果红染料鉴定，看菌落周围是否出现透明圈5、某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如下。
将各种物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL，再经高温灭菌，制成固体培养基备用。
(1))，原因是________________________________。
(2)培养基常用________法灭菌，培养皿常用________法灭菌，待培养基冷却到________(填“20”、“30”、“40”或“50”) ℃左右时，在________附近倒平板，等平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，可以防止________________，造成污染。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.重复组的结果是否一致
如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操 作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指 示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基 的颜色变化。
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。Leabharlann 2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在 30～300的平板，则说明稀释操作比较成 功，并能够进行菌落的计数。
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选 作用？如果有，又是如何进行筛选的？
有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合 成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
二、 统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释 度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源 于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释 度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果 准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板 上，培养后再选择菌落数在30 ～300的平板进行 计数。
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有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
（二）统计菌落数目：
1、活体计数法（稀释涂布平板）
（1）操作方法：
稀释涂布平板→统计菌落数
（2）原理：
1个菌落→1个活菌
（3）统计原则
①选 30∼300 个菌落的平板统计
②每个稀释度取3个平板取其平均值
第一位同学只涂布了一个平板，没有设置 重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学设置了重复组，涂布了3个平板， 但是，其中1个平板的计数结果与另 2个相差太
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有
其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有 说服力。
五、结果分析与评价
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择
培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，
说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的
菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选
择培养基已筛选出一些菌落。
2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在
30～300的平板，则说明稀释操作比较成
功，并能够进行菌落的计数。
3.重复组的结果是否一致 如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结
果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操
作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定 鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基 的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指
一、 筛选菌株
原理 人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、 温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生
长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养
基，称做选择培养基。
能分解尿素的细菌的筛选
1、在培养基的配方中，为微
（一）筛选菌株 生物的生长提供碳源和氮源的分别是 KH2PO4 1.4g 是什么物质？ NaHPO4 2.1g 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 2.分析该配方的培养基对微 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 生物是否具有筛选作用？如果有， 将上述物质溶解后， 又是如何进行筛选的？ 用蒸馏水定容到 1000mL。 有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只
㈤.微生物的培养与观察 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数 目。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30— —300的平板，则说明稀释操作比较成功， 并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数 的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不 精确，需要重新实验。
示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基
的颜色变化。
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ A ） A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ C ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) D A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
㈣.取样涂布
◆实验时要对培养皿作好标记。注明培 养基类型、培养时间、稀释度、培养物 等。
㈣.取样涂布
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
稀释倍数 目的
细菌
104、105、106
放线菌
真菌
103、104、105
102、103、104
ห้องสมุดไป่ตู้
保证获得菌落 数在30～300 之间、适于计 数的平板
原因：不同微生物在土壤中含量不同
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的
信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用
前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 火焰旁进行
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的 数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低
远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，
不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，
作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。 在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组 的结果是否基本一致，结果不一致，意味着操作 有误，需要重新实验。
（二）统计菌落数目 1、活菌计数法 为什么？ （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的 实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表 示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。
课题2
一、课题背景
尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸 收利用 细菌脲酶 CO(NH2)2+H2O CO2 +NH3
示
标
1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌
躬 学
• 阅读教材P21-23
知道尿素被分解的反应式 实验室中微生物的筛选，原理是什么? 思考P22〈旁栏思考〉 统计菌落的方法是什么，结果用什么表示？ 设置对照的目的是什么?
2、显微镜直接计数
㈡.统计菌落数目： 1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
实践训练
4.下列说法不正确的是（ B ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。