免疫组化特殊染色试剂
医院病理科免疫组化及特殊染色工作制度
医院病理科免疫组化及特殊染色工作制度
免疫组化和特殊染色已经成为现代病理学中不可或缺的重要工具，准确的免疫组化和特殊染色可极大地帮助病理诊断，或提供准确的分子治疗靶标；而不准确的免疫组化和特殊染色反而产生误导，造成误诊。
因此必须对影响免疫组化和特殊染色的各个环节进行严格的质控，对技术人员和病理医师进行培训，保证准确的染色结果和正确的结果判读。
1、免疫组和特殊化染色是特殊的技术，相关操作人员必须经过专门的培训。
2、每一批次的免疫组化和特殊染色必须设阳性和阴性对照，可利用组织中的内对照。
3、必须建立本实验室每种免疫组化和特殊染色的操作规程，并根据染色效果及时更新。
4、更换抗体或试剂后，需要用阳性和阴性组织对新试剂进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。
5、免疫组化和特殊染色过程中产生的有毒液体应专门回收，严禁随处倾倒。
6、病理医师必须熟悉各种抗体染色结果和特殊染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。
7、免疫组化和特殊染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断，并将染色结果写到病理报告中。
按免疫组化和特殊染色工作单要求，及时制片，一般要在1～2个工作日出结果。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
免疫组化及特殊染色ppt课件
免疫组化及特殊染色
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与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
免疫组化及特殊染色
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IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
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抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
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2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
免疫组化染色技术
[分享] 免疫组织化学染色技术法医学院官大威第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ结果：病变处脂肪组织呈橙黄色目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS(pH 7.6)方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C 孵育20 min。
结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。
注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法.常规HE染色（hematoxylin and eosin staining）.组织学特殊染色1. Mallory 三染色、Masson三染色2. 神经纤维的镀银染色3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。
三、超微结构的观察.光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2μm有效放大倍数最高不超过2000倍。
电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。
第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemical technique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1. 免疫荧光细胞化学技术2. 免疫酶细胞化学技术3. 免疫铁蛋白技术4. 免疫金-银细胞化学技术5. 免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理.抗原（antigen）1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。
免疫显色试剂说明书
免疫显色试剂说明书【产品名称】免疫显色试剂【包装规格】【预期用途】在免疫组化反应或原位杂交反应中与首要抗原抗体结合，通过染色，将靶点进行标记。
【检测原理】免疫显色试剂是二步法免疫组化试剂盒，适合与兔或鼠源一抗配用。
其主要过程为，一抗与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物与抗原抗体复合物中的一抗结合，再利用辣根过氧化物酶催化二氨基联苯胺（DAB）在抗原部位形成棕色显色。
由于该系统不含生物素和链亲和素，所以不受内源性生物素干扰，染色背景非常清晰。
【主要组成成分】其他需要但未提供的材料：PBST缓冲液（pH7.2-7.4）、纯化水、酒精、脱蜡液、苏木素染色液、中性树胶、塑料湿盒、染色缸、染色架等。
【储存条件及有效期】储存条件：2-8℃，有效期18个月。
请在开瓶3个月内使用。
生产日期、有效期至：见标签。
【样本要求】常规经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。
【检测方法】常规脱蜡水化：石蜡切片经常规脱蜡和水化。
抗原热修复：参照一抗说明书进行抗原修复。
DAB工作液的配制：按每毫升DAB缓冲液（试剂D）中加入50μL DAB色原（试剂C）（约1滴）的比例配制DAB工作液，DAB工作液应现配现用。
配制好的DAB 工作液需在2小时内使用，如出现沉淀，使用前先混匀。
操作步骤：1）抗原修复完毕后自然冷却的切片，用自来水清洗。
2）除去切片上组织周围的液体，用免疫组化笔圈定玻片上的待测组织区域并放入PBST缓冲液中。
3）取出切片，除去PBST缓冲液，滴加内源性过氧化物酶阻断剂（试剂A）（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上孵育10分钟，用PBST清洗切片。
4）除去PBST缓冲液，滴加100μL左右一抗工作液（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上进行孵育（按照各自一抗说明书操作）。
一抗孵育完毕，用PBST清洗切片。
5）除去PBST缓冲液，每张切片加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（试剂B）100μL左右（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），室温下孵育30分钟。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍一、用于鉴别诊断(一)上皮源性:1、细胞角蛋白/cytokeratin、CK:目前,商品化得细胞角蛋白有20多种,不同得分子量代表不同类型得上皮标志。
通常将CK分为两大类型:Ⅰ型(低分子量);Ⅱ型(高分子量)。
理论上讲,大多数单层上皮表达低分子量得C K;复层上皮多表达高分子量得CK;移形上皮(膀胱)与假复层上皮(呼吸道得被覆上皮)既表达低分子量得CK,也表达高分子量得CK。
在癌组织中,低分子量得CK多在腺癌中表达,高分子量得CK多在鳞癌中表达。
目前为止,未发现任何一种上皮只含有一种CK,某些上皮可含210种不同分子量得CK。
因此,目前试图应用单一得CK免疫表型来确定某种特定得上皮性肿瘤就是不可能得。
同样,应用CK来区别腺癌、类癌与间皮瘤也就是困难得。
因此,CK得免疫组化结果判断就是一个较为复杂得问题,在应用这类标记物作为腺癌与鳞癌得鉴别应特别注意。
有必要时,应联合用多种CK加以综合判断。
CK得阳性表达还包括有间变癌、双向分化得滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。
CK得阴性表达有:副节瘤单向分化得滑膜肉瘤、软骨(肉)瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤(除特殊类型外)。
在判断CK免疫组化结果时应注意几点:(1) CK得单克隆抗体优于多克隆抗体;(2) CK常出现斑点状得假阳性反应,应注意识别;(3) 虽然大多数CK多在胞浆表达,但CK17多在胞核表达;(4) 绝大多数CK抗体需用胰酶消化,可增加阳性表达率与染色强度;(5) 部分非上皮性肿瘤(平滑肌肉瘤)可见有CK表达,在诊断时应注意;(6) 淋巴结、扁桃体与脾组织中得滤泡外得网织细胞含有CK8与18以及desmin,在判断淋巴结转移癌与肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。
2、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen/EMA):EMA就是上皮细胞分泌得一种乳脂小球膜糖蛋白,广泛存在于人体各种上皮细胞中(也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞与T细胞淋巴瘤中),其分布与角蛋白相似,但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白,尤其就是分化差得癌EMA有时可呈强阳性表达。
常用免疫组化试剂介绍完整版
常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。
它们能够与目标分子发生特异性的结合反应，通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。
常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。
下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。
一、抗体单克隆抗体：单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。
它们具有更高的特异性和一致性，适用于特定的免疫组化实验。
单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。
二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。
在免疫组化实验中，常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。
DAB：DAB（3,3'-二氨基联吡啶）是一种常用的免疫组化染色底物。
当DAB与过氧化物酶结合后，在特定条件下会产生棕色沉淀物，用于检测目标分子的位置。
VIP：VIP（维珍纳胶体阳离子）是一种特殊的底物，其在经过过氧化物酶催化后，形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。
VIP用于染色后，可以形成黑色沉淀物。
AP：AP（碱性磷酸酶）是一种常用的底物，可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。
AP基质有两种常用的类型，一种是快速红色溶液（Fast Red），另一种是紫色溶液。
HRP：HRP（过氧化物酶）是一种广泛使用的底物，在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。
HRP染色通常呈现为褐色或黑色。
三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。
免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。
FITC：FITC（荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯）是一种常用的绿色荧光染料，其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。
TRITC：TRITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用的红色荧光染料，其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。
Cy3：Cy3是一种荧光发色团，其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。
Cy5：Cy5是一种荧光发色团，其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。
免疫组化在同一张玻片上做2种免疫抗体检测
处理 要求分 别进行 酶消 化 、 柠檬 酸及 Ｅ Ｔ Ｄ Ａ高 压抗
原修 复 等 相 应 处 理 。再 用 蒸 馏 水 洗 ２次 ， ｒ ｎ ３ ｉ， ａ Ｐ Ｓ ２次 ，ｍ ｎ Ｐ Ｓ每 ２ ０ ｌ 曲拉 通 Ｘ一１０ Ｂ洗 ３ ｉ（ Ｂ ０ｍ 加 ０ １ 。下 同 ） 滴 。用 Ｐ Ｐ笔在距 离 组织 周 围 ３～ ｍ Ａ ４ｍ
１２ 方 法 ．
标 本 经 １ ％ 福 尔 马 林 固定 ， 规 脱 ０ 常
水， 石蜡 包埋 ， 片厚 度 ３ｘ 切 Ｉ ｍ。切 片 时在磨 砂标 签 预 留处标记 好抗体 名称 ， 把相 同预处 理要求 的 ２种 抗体 名称标 记 于 同一 玻 片上 ， 中问 用／ 隔 开 。取 号
片时， 分左 右在 同一 玻 片上 置 ２片组织 切 片 （ 片 玻 事先经 Ａ Ｅ Ｐ Ｓ胶处 理 ） 中 间视 组织 块 大 小 留有适 ，
一 一
图 １ ＣＫ ０（ 水 ： 癌 ） ２ 胸 腺
３ 讨 论
免 疫组 织 化 学 又 称 免疫 细胞 化 学 ， 利用 抗 是
原与抗 体 问 的 特 异 性 结 合 原 理 和 特 殊 标 记 技 术 ， 对 组织 和 细胞 内的 特 定 抗 原 或 抗 体 进 行 定 位 、 定 性 或定 量 检 测 的 一 门技 术 … 。在 病 理 实 际 工 作 中， 免疫 组 化 技术 作 为 一 种 常规 应 用 于 外 科 病 理
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１ ０８ ・ ４
浙江 』 医 学 ２ １ 临床 ００年 ｌ 第 １ 第 】 ２月 ２卷 ２期
免 疫 组化 在 同一 张玻 片上 做 ２种免 疫 抗体 检 测
孟 丽 陶丹华 潘 秀兰
免疫 组化 目前在 病 理诊 断 和 科研 １ 作 中应 用 十分 普遍 ， 材 量 也很 大 。为 了减 少 试 剂 材 料 消 耗
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碱性刚果 红染色液 (淀粉染 色) 纤维素染 色液 嗜银颗粒 染色液 肥大细胞 染色液 基底膜银 染色液
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Masson氏 改良三色 染色液 网纤染色 液 AB-PAS肠 化生粘液 染色液 AB-PAS肠 化生粘液 染色液AB AB-PAS肠 化生粘液 染色液PAS 胃幽门螺 杆菌 LeungGibbon氏 染色液 胃幽门螺 杆菌双色 染色液 抗酸杆菌 染色液 革兰氏细 菌染色液 瑞氏染色 液 吉姆萨染 色液 新型隐球 菌.霉菌 染色液 胶原纤维 VG染色液 弹力纤维 染色液 Mallory 磷钨酸苏 木素染色 液 脂肪染色 液(苏丹 111染色 液) 含铁血黄 素染色液 (普鲁士 兰) 黑色素染 色液
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结缔组织 染色 网状纤维 肠化生染 液 阿利新蓝 PH2.5染 色液 过碘酸雪 夫氏染色 液
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HP染液