多维高效液相色谱毛细管电泳模式在蛋白组研究中的应用
说明毛细管电泳特点及应用
说明毛细管电泳特点及应用
毛细管电泳是一种高效液相色谱技术，其基本原理是利用电场将带电粒子在毛细管中的移动速率和荷电量的差异进行分离和富集。
毛细管电泳具有高分离效率、快速分离、小量样品、自动化程度高等特点，已经成为了化学、生物、环境学等领域的一个重要分析工具。
其主要应用领域和特点如下：
1.分离生化分子
毛细管电泳可以用于分离和富集DNA、RNA、蛋白质、糖类和小分子有机物等生物分子。
这些生物分子在酸碱性、水解、氧化还原等条件下有不同的化学性质和电荷性质，可以被毛细管电泳技术精确分离和定量。
例如在DNA分离和定量方面，毛细管电泳已经成为PCR扩增产物检测、基因测序、DNA指纹鉴定等分子生物学技术中的重要手段。
2.分析环境污染物
毛细管电泳可以用于环境监测和食品安全检测等领域，可以对水、空气、土壤和食品中的有机和无机污染物进行快速准确定量分析。
例如利用毛细管电泳技术可以分析环境中的氨、硝酸盐、荧光增白剂、PESTICIDE 等有害物质含量，以及酒类中的苯甲酸、乙酸等有害物质。
3.分析药品和代谢产物
毛细管电泳可以快速、灵敏地分离和鉴定药品和代谢产物，具有药动学和毒理学研究的重要意义。
毛细管电泳技术节省反应时间，减少实验操作时间，可对液-液、液-固、固-液等反应进行分离和分析，得到精确的数据和结果。
如利用毛细管电泳技术，可以分析身体内的有机酸、氨基酸、代谢产物等物质。
总之，毛细管电泳技术在化学分析和生物分析中均有广泛应用，且已成为学术研究和工业生产的一种重要分离分析手段。
毛细管电泳分离蛋白质研究
毛细管电泳分离蛋白质研究蛋白质是生命体中重要的组成部分之一，对维持生命机能和完成生命过程具有重要作用。
因此，对蛋白质的研究一直是生命科学领域的热点问题。
而毛细管电泳作为一种高效、高灵敏、高分辨的方法，已成为蛋白质分离和分析的常用手段之一。
什么是毛细管电泳？毛细管电泳是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。
它利用毛细管内充满缓冲液，通过在毛细管中施加电场，将不同电荷和大小的蛋白质分离开来。
毛细管电泳和传统的凝胶电泳相比，具有更高的分辨率和灵敏度，样品需求量也更小。
毛细管电泳的优势毛细管电泳的优势主要有以下几点：1. 高分辨率：毛细管电泳可以分离出大小相差1-3%的蛋白质，而传统的凝胶电泳只能分离出10%以上的蛋白质。
2. 高灵敏度：毛细管电泳可以检测到微量蛋白质，而凝胶电泳的灵敏度较低。
3. 快速：毛细管电泳的分离速度快，比手性高效液相色谱要快10倍以上。
4. 自动化：毛细管电泳可以与多种检测方法结合使用，实现自动化检测。
毛细管电泳分离蛋白质的原理毛细管电泳分离蛋白质的原理是基于电荷和大小的差异。
蛋白质在毛细管中的运动速度与电场强度、离子缓冲液等多个因素有关。
在电场作用下，带有正电荷的蛋白质会向负电极移动，带有负电荷的蛋白质则向正电极移动。
而整体电荷为中性或近中性的蛋白质则不运动或运动极慢。
此外，蛋白质的大小也会影响其在毛细管中的运动速度。
较小的蛋白质分子可以通过毛细管的孔径，运动速度相对较快；而较大的蛋白质分子则相对较慢。
毛细管电泳分析的步骤毛细管电泳分析一般分为以下步骤：1. 样品预处理：将样品通过离心、过滤、去除盐等方法处理干净，以获得高质量的分离结果。
2. 毛细管填充：将毛细管填充缓冲液，以避免产生电荷扰动和样品游离。
3. 样品注入：将样品加载到毛细管中，一般通过注射器或电动势力注射等方法。
4. 施加电场：毛细管内施加电场，使电荷带正的蛋白质向负电极移动，电荷带负的蛋白质向正电极移动，而中性或近中性的蛋白质分子则不运动或运动极慢。
高效液相色谱在蛋白质分析中的应用
高效液相色谱在蛋白质分析中的应用蛋白质是生命体内最重要的分子之一，它参与了几乎所有细胞生物过程，包括信号传导、代谢调控和结构支持等。
因此，研究蛋白质的结构和功能对于深入理解生物学的基本原理至关重要。
而高效液相色谱（HPLC）作为一种广泛应用于蛋白质分析的技术，具有高分辨率、高精确性和高灵敏度等优势，已经成为蛋白质分析的重要工具之一。
HPLC是一种在液相中进行分离和定量的色谱技术。
它可以通过对样品中的分子进行溶解和分离，得到各个组分的峰值，并通过峰的面积或高度来确定样品中目标分子的含量。
在蛋白质分析中，HPLC可以用来实现多种分离方式，包括离子交换、逆向相和亲和层析等。
这些技术可以根据不同的样品特性和分析目的来选择，从而实现对蛋白质的有效分离和定量。
离子交换色谱是HPLC常用的一种技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。
该技术通过样品中蛋白质与固定在色谱柱填料上的离子交换基团之间的相互作用，实现分离和定量。
具体来说，当样品溶液通过填料时，离子交换基团会与蛋白质表面的带电部分发生静电作用，使得带电的蛋白质分子在固定相和流动相之间进行反复吸附和解吸附。
通过改变流动相的pH值和离子浓度等条件，可以调控蛋白质在离子交换柱上的保留和洗脱，从而实现对不同蛋白质的分离和纯化。
逆向相色谱也是常用的HPLC技术之一，可用于蛋白质的分离和定量。
逆向相色谱的原理是将样品中的目标蛋白质与填料上的疏水基团发生相互作用，从而实现分离。
与离子交换色谱不同的是，逆向相色谱需要通过有机溶剂和缓冲液的梯度洗脱来控制目标蛋白质的保留和洗脱。
逆向相色谱具有较高的选择性和灵敏度，可以实现对多个蛋白质的同时分离和定量，适用于复杂样品的分析。
亲和层析是HPLC中常用的一种选择性分离技术，通过特定配体与目标蛋白质之间的特异性结合而实现对蛋白质的分离。
亲和层析可以通过配体的特异性识别目标蛋白质的结构域或功能基团，从而实现高效分离。
例如，将金属离子与亲和剂配合，可以选择性地吸附含有特定金属结合位点的蛋白质；将抗体或受体蛋白固定在填料上，可以选择性地捕获与之结合的配体或激素蛋白质。
毛细管电泳技术在检测分析中的应用
2011-12-31 毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用摘要：毛细管电泳技术(CE)作为现今一种主要的分析技术，凭借其高效、灵敏、快速、设备简单、广泛适用性等特点，广泛应用于各个领域。
本文简要概述了CE技术的原理及特点，并简述了它在环境分析、食品分析、药物分析、生物大分子分析等各个领域的应用。
关键词：毛细管电泳；分析；应用1.毛细管电泳技术简介1.1 产生与发展毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）是一种在电泳技术的基础上发展的一种现代分离技术。
电泳技术作为一种分离技术已有近百年历史，1937 年A.Tiselius首先提出：传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。
1967年，Hjerten最先提出了毛细管电泳的雏形，即在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳。
但他并没有完全克服传统电泳的弊端。
直至1981年Jorgenson和Lukacs提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 这时现代毛细管电泳技术真正产生。
1984 年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。
（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。
（3）操作模式多，开发分析方法容易。
（4）实验成本低，消耗少。
（5）应用范围极广。
自1988年出现了第一批毛细管电泳商品仪器，短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。
毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展
（ ＤＮＡ） 的分离 分析要 求 ， 而得到 了迅 速发展 。
２ 毛 细管 电泳 的 分 类
２ １ 毛细 管区带 电泳 （ ａ ｉ ａｙｚｎ ｌ ｔｏ ｈ ｒｓ 。 ． Ｃ ｐｌ ｒ ｏ ｅｅ ｅｒｐ ｏ ｅｉ ｌ ｅ ｓ
Ｃ Ｅ） Ｚ
蛋 白质生 物制 品是 当今 生物 医药产业 的重 要组成 部 分 ， 年来 随着 Ｄ 近 ＮＡ 重组 与克 隆技 术 的 飞速 发展 ，
速 发展 时期 ， 先后 出现 了熔 融石英 毛 细管 、 毛细 管凝胶
ｐ ｏｅｉ， Ｃ ， 近 ２ ｈ ｒｓ ＨＰ Ｅ） 是 ｓ Ｏ年 迅 速发 展 的一 种 快 速 的
分离分析技术［ 。毛细管 电泳是 以毛细管为分离通 １ ］
道， 由高压 电场 提供 驱动力 ， 根据待 分析 物质各 组分在
毛 细管 内淌度或 分 配 系数 的不 同 ， 即各 组分 沿 管 轴方
电泳 、 毛细管 等 电聚焦 、 束 电 动 毛细 管 色 谱 、 细 管 胶 毛
电色谱 。１ ８ 年 ，ｏ ｇ ｎ ｏ ９ １ Ｊ ｒ ｅ ｓ ｎ和 Ｌ ｃ ａ 用 石英 毛 细 管 ｕｋ ｓ
进行 电泳分 析 ， 促进 电泳 技术 发生 了根本 变革 ， 迅速 发 展成 为 可 与 ＧＣ ＨＰ Ｃ相 媲 美 的崭 新 的分 离 分 析 技 、 Ｌ 术［ 。１ ８ ６ ９ ９年 ， ］ 第一 台商 品化 毛细 管 电泳仪 问世 。短 短几 年 内 ， 由于 毛细管 电泳符 合生命 科 学领域 的主要 因素 。毛 细 管 电泳 技 是 术 用 于蛋 白质生物 制 品的分析 具有 明显 的优 势 。作 者 在 此 就近年 来 国内外毛 细管 电泳技术 在蛋 白质生 物制
品分 析 中的应用研 究进 展进行 了综述 。
多维液相色谱分离技术及其在蛋白质组研究中的应用
采用多根并行色谱柱同时进行分离的方式缩短整个
MDLC系统的分离时间, 从而实现复杂样品的高通 量分离分析。W agner等 [ 21] 最早采用并行的两根反 相液相色谱柱作为第二维分离模式构建了 2D SCX RPLC, 并对人胎儿纤维原细胞裂解液中的蛋白质进
图 1 2D SCX 阵列 RPLC M S /M S 联用系统示意图 [ 23] F ig. 1 Schem atic d iagram of 2D SCX array RPLC M S /M S sy stem [ 23]
此外, 整体柱具有传质速度快、背压低等优点, 可通过采用细内径、长柱长的色谱柱提高 2D SCX RPLC的分离能 力、分 析通 量和检 测灵敏 度。 Luo 等 [ 24] 制备了 3 2 m 长、10 m 内径的聚苯 乙烯毛 细管开管整体柱, 并将其作为第 二维分离模式, 从 75 ng宫颈癌细胞提取蛋白质胶上分离的 15 000 ~ 40 000处条带的酶解产物中鉴定出 536种蛋白质。
行分析; 在 95 m in 内得到了 1 000个色谱峰。张祥 民等 [ 22] 以 SCX 作为第一维分离模式, 10根平行的 RPLC柱 作为第二维分离模式, 构 建了 2D SCX 阵 列 RPLC系统, 并从肝癌组织中提取的蛋白质酶解 产物中鉴定出 1 202种蛋白质。随后该研究小组将 强阳离子交换分离的 18个组分捕集到 18根预柱上 后, 再将其转移 至 18 根毛细管 RPLC 柱上进 行分 离, 最 后 直 接 点 样 至 基体 辅 助 激 光 解 吸 离 子 化 (MALDI)质 谱 的靶 板 上进 行 鉴定。整 体系 统 如 图 1[ 23] 所示。与传 统的 2D SCX RPLC 相比, 可将 蛋白质组样品的分离时间由 54 h缩短至 3 h, 分离 通量提高 18倍。
毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展
毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展曹卫荣;张世光;王晓婧;周青青;邹卫【摘要】毛细管电泳技术作为一种快速的分离分析技术,具有分析速度快、分辨率高、重现性好、定量分析准确、分离模式多样等特点,在蛋白质生物制品的定性定量分析中发挥着重大作用.就毛细管电泳技术的演变、分类及其在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展进行了综述.%Capillary electrophoresis(CE) is a kind of rapid separation and analysis technology with fast analysis speed,high resolving power,good reproductbility,accurate quantification and a variety of separation modes. CE plays an unique role in the analysis of protein biological products. In this paper, the evolution of CE,the classification of CE,and its application in protein biological product analysis are reviewed.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】4页(P20-23)【关键词】毛细管电泳;蛋白质生物制品;毛细管凝胶电泳;毛细管区带电泳;微芯片毛细管电泳【作者】曹卫荣;张世光;王晓婧;周青青;邹卫【作者单位】石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北石家庄050051;石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北石家庄050051;石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北石家庄050051;石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北石家庄050051;石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北石家庄050051【正文语种】中文【中图分类】TQ937;O657.8;Q816毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)，又称高效毛细管电泳(High-performance capillary electrophoresis，HPCE)，是近20年迅速发展的一种快速的分离分析技术[1]。
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用随着生物医学领域的不断发展，越来越多的医学研究需要用到高效、准确的分析方法。
毛细管电泳技术作为一种高效、低成本、快速而且对样品无损的检测方法，在生物医学领域得到了广泛的应用。
本文将从毛细管电泳技术的原理、优势和应用方面进行探讨。
一、毛细管电泳技术的原理毛细管电泳技术是利用毛细管内表面电荷的存在、电场的作用和离子在电场中的迁移速度差异，将样品中的各种离子或分子进行分离的一种技术。
毛细管的内壁带有固定电荷，当毛细管两端通以电荷正负相间的电场后，样品中的负离子会被向阳极迁移，正离子则会被向阴极迁移。
由于不同分子的离子迁移速度差异不同，因此，分离出来的分子具有不同的速度，最终在毛细管中形成一道道不同的峰。
二、毛细管电泳技术的优势毛细管电泳技术具有以下优势：1、高效快速：毛细管电泳技术的分离效率高、分离速度快，可在短时间内完成样品分析。
2、高分离效果：毛细管电泳技术的分离效果好，能分离出非常相似的分子，如同构体和同分异构体等，并且可对几百种物质进行同时分离。
3、低成本：毛细管电泳技术所需成本相对较低，并且无需大型设备和复杂的仪器。
4、无损害：毛细管电泳技术对样品不会造成损害，并且可对生物大分子进行分离。
三、毛细管电泳技术在生物医学领域中已经得到了广泛的应用，其中包括：1、蛋白质分离和鉴定：毛细管电泳技术与质谱技术结合，可以快速高效地实现蛋白质的分离和鉴定。
毛细管电泳技术分离出的蛋白质样品可以与其他分析技术结合，如质谱技术，以进行更深入的分析。
2、核酸分离和鉴定：毛细管电泳技术可用于对DNA、RNA、mRNA和寡核苷酸等的分离和鉴定。
在分离和鉴定这些分子时，毛细管电泳技术在速度和准确性方面具有独特的优势。
此外，该技术还可用于药物筛选和基因检测等领域。
3、药物代谢研究：毛细管电泳技术可用于研究潜在的药物代谢通路。
通过毛细管电泳技术的高效分离，可以分离并鉴定药物代谢产物及其结构，并在药效学和毒理学方面提供有用的信息。
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收稿日期:2002212213作者简介:张丽华,女,1973年生,博士.通讯联系人:张玉奎,研究员,博士生导师,Tel/Fax :(0411)3693427,E 2mail :ykzhang1@.基金项目:中国国家重点基础研究发展规划(973)项目(001CB510202).多维高效液相色谱/毛细管电泳模式在蛋白组研究中的应用张丽华1,2, 张维冰3, 张玉奎3, 马场嘉信1,4,5(1.日本 岛大学 学部 品物理化学教室,日本 岛77028505;2.日本古野电株式会社,日本西 66228580;3.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116011;4.略基础研究推进事业 (CREST ),日本科学技术振兴事业日本千叶29220812;5.日本产业技术合研究所四国中心,日本高松76120395)摘要:对多维高效液相色谱/毛细管电泳模式的发展及其在蛋白质和多肽分析中的应用进行了系统综述。
该模式具有快速、重现性好、易于实现自动化的优点,很容易实现和质谱的联用,对于在样品中丰度低和疏水性强的蛋白质的分析也具有明显的优势。
引文67篇。
关键词:多维液相分离;高效液相色谱;毛细管电泳;蛋白组;综述中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2003)0120032206Multidimensional High Performance Liquid Chromatography/C apillaryElectrophoresis Used for Proteome AnalysisZHAN G Lihua 1,2,ZHAN G Weibing 3,ZHAN G Yukui 3,BABA Y oshinobu 1,4,5(1.Depart ment of Medicinal Chemist ry ,Faculty of Pharm aceutical Sciences ,The U niversity of Tokushim a ,Tokushim a 77028505,Japan ; 2.Furuno Elect ric Co.,L td.,N ishinomiya 66228580,Japan ; 3.Dalian Institute of Chemical Physics ,The Chinese Academy of Sciences ,Dalian 116011,China ; 4.Core Research Evolution Science and Technology ,Japan Science and Technology Corporation ,Chiba 29220812,Japan ;5.N ational Institute of A dvanced Indust rial Science and Technology ,Takam atsu 76120395,Japan )Abstract :The description of the methodology and its applications in proteome analysis has been sum 2marized with 67references ,and the potential for its further applications in proteomics is discussed.K ey w ords :multidimensional liquid phase separation ;high performance liquid chromatography ;capil 2lary electrophoresis ;proteome ;review 随着人类基因测序的基本完成[1,2],人类基因组计划(Human G enomic Project )开始进入到后基因组时代。
蛋白组学(proteomics )已经成为功能基因组学研究的重要领域,其重要性和战略意义日益显著。
蛋白组学包括表达蛋白组学(expression pro 2teomics )[3]和功能蛋白组学(functional pro 2teomics )[4]两部分内容。
表达蛋白组学研究基因编码所有蛋白质的识别和定量,及其在细胞中的定位和在后转录阶段进行的修饰。
而功能蛋白组学主要研究蛋白质之间的相互作用,确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用,说明蛋白质结构和功能间的相互关系。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D 2PA GE )是一种利用蛋白质等电点和分子大小的差异进行正交分离的分析方法,自从1975年由O ’Farrell 建立以来[5],该方法因其无法比拟的高分辨率而在蛋白质组研究中始终占据着重要的地位[6～9]。
然而2D 2PA GE 也存在一些难以克服的缺陷,比如有限的动态范围和分离样品中大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白(如信号蛋白和转录因子)以及疏水蛋白(膜结合蛋白和跨膜蛋白)的能力,操作过程费时费力,难以实现与质谱(MS )的直接联用等。
这些缺陷限制了其在蛋白组学中的应用,因此发展新型高分辨率、高通量、高峰容量的分离分析方法已成为加快蛋白组学研究的关键[10～15]。
近年来,高效液相色谱(HPLC )和毛细管电泳(CE )的发展为蛋白质和多肽的分离分析提供了新的手段。
然而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限。
多维HPLC/CE 方法可以采用多种不同的HPLC 模式(尺寸排阻色谱(SEC )、离子2003年1月January 2003色谱Chinese J ournal of Chromatogra phyVol.21No.132～37交换色谱(IEC)、亲和色谱(AC)和反相液相色谱(RPLC)等)和CE模式(毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、等电聚焦(CIEF)、胶束电动色谱(M EKC)和毛细管电色谱(CEC)等)通过在线或离线的方式进行偶联,从而实现对复杂样品的分离。
尽管这种新型的多维液相分离模式的分辨率和2D2PA GE相比仍有待进一步提高,但它具有以下优点:灵敏度高、分析速度快;可以通过不同分离模式的偶联来实现对样品中分子大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白以及疏水蛋白的分析;可以直接和MS联用;易于实现系统的自动化等[10]。
因此,作为和2D2PA GE互补的一种分离模式,它在蛋白组学研究中已开始发挥重要的作用。
本文基于对多维分离模式理论的介绍,系统综述各种多维HPLC/CE模式的组成及其在蛋白组研究中的应用。
1 基础理论 与一维分离模式相比,多维分离技术的最大特点是可极大地提高峰容量。
最近,G iddings[16]指出峰容量的提高程度和样品组分分布的有序程度有着密切的关系。
他还提出了样品维数(sample dimen2 sionality)(能够精确识别样品组分的变量数)的概念,并认为当样品维数大于系统维数时,组分的峰分布是无序的,会限制分离的效果;如果样品的维数小于系统维数,尽管组分的峰分布是有序的,但多维系统的高峰容量的性能并没有得到发挥;只有当这两个维数相等时,才能充分发挥多维系统的分离能力。
根据G iddings建立的数学模型,多维分离模式的峰容量应为其构成的各个一维分离模式的峰容量的乘积[17]。
然而由于溶质在多维分离模式下保留行为的相关性减少了在限制性区域内的保留空间,该公式只能用来对多维模式的峰容量进行估计。
Liu等[18]在考虑各一维模式的峰容量、正交分离中峰展开角(spreading angle)和二维保留空间的基础上,从理论上得到了二维分离模式下实际峰容量的计算公式。
该表达式不仅能够评价多维分离模式的性能,而且可以用于系统的条件优化。
Slonecker 等[19]也采用定性信息相似性技术(qualitative infor2 mational similarity technique),通过对信息熵、交互信息和信息相似性的计算,根据46种不同性质的溶质在各种一维分离模式下(反相液相色谱、超临界色谱、气2液色谱和胶束电动色谱)的保留时间推测出其在二维模式下信息的正交性。
这种方法可以在较短的时间内确定出适合溶质分离的二维系统。
在二维分离模式下,第二维的采样速度不仅决定了样品的分析时间,而且对系统的选择性也有着至关重要的影响。
Murphy等[20]从理论和实验上对二维色谱中采样速度的影响进行了深入的研究。
结果表明进入第二维分离的采样时间越短,整个系统的选择性越高。
为了获取最大的选择性,对于同步采样来说,进入第二维分离的每一个峰应该至少采样3次;而对于非同步采样,采样的次数则应该增加到至少4次。
这些结果为多维色谱方法的发展奠定了理论基础。
2 多维高效液相色谱/毛细管电泳模式 人们对蛋白组的研究可以分为“全谱”(profiling mode)和“目标谱”(target mode)两种模式。
前者是对于复杂混合物(如细胞的溶解产物)中所有蛋白质的分析;而后者则是对其中一种或某一类组分的分离分析。
针对不同的研究目的,在多维液相分离中采用的分离模式也将不同。
前者主要采用几种高分辨率的分离模式,而后者其中的一维通常是高选择性的亲和分离模式。
根据分离机理的不同,可以将多维分离模式大致分成多维HPLC、多维CE以及多维HPLC2CE三大类。
此外,根据各维分离模式间连接方式的不同,也可以分为在线分离和离线分离两类。
由于在线分离具有分辨率高、无样品损失、快速、高通量和易于实现自动化操作等优点,这里主要介绍各种分离模式的在线偶联。
2.1 多维高效液相色谱 目前多维HPLC在蛋白组学研究中占有十分重要的地位。
由于反相液相色谱具有分析速度快、分离效率高、流动相组分与MS匹配等优点,通常被选为多维色谱分离中最后一维的分离模式。
而SEC,IEC和AC等可以作为样品的预分离模式。
2D2SEC2RPLC的工作最初由Opiteck等开展。
如图12a所示,他们将6个相连的SEC柱和两个平行的RPLC柱通过四通阀相连构成整个分离系统[21]。
样品中的组分根据分子尺寸大小在SEC柱被分离后,交替进入RPLC柱上,再依据其疏水性的不同进行二维分离。
其中一根RPLC柱进行流出组分收集和脱盐的同时,另一根平行的RPLC柱进行组分分离。
分离的组分可在柱后采用UV或MS直接进行检测。
这种分离系统不仅可以快速、有效地收集一维分离的组分,缩短样品的分离时间,而且一维的流出组分还可以在RPLC的柱端进行柱上浓缩。
在3h内,采用紫外(UV)可以检测到人血清白蛋白49个胰蛋白酶酶解产物中的48个,而利用MS可以检测到58个肽(49个胰蛋白酶酶解肽和9个非胰蛋白酶酶解肽)。