蛋白质组学及其主要技术

蛋白质组学及其主要技术

朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校)

(1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学

科，广东深圳518036)

【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。

【关键词】蛋白质组，蛋白质组学

1蛋白质组学的概念

随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。

2蛋白质组学的常用技术

2.1样品的制备和蛋白质的分离技术

2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。

激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。

2.1.2蛋白质的分离技术

①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于

l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。

第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复

性好。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，它是按蛋白质分子量的大小进行分离，双向电泳的最新进展是用IPG干胶条代替两性电解质加上与干胶条相配套的电泳仪如PROTEAN IEF Cell、IPG-phort等进行第一向等电聚焦[7,8]，不仅极大地提高了电泳的分辨率，也提高了结果的重复性，尤其是不同实验室之间结果的可比性。2-DE最大的应用是能分离相同分子量的同分异构体以及经过翻译后修饰的蛋白质，蛋白质经过诸如磷酸化后，其电荷数量发生改变。通常蛋白质的磷酸化形式可以与未磷酸化的对应物分离开，在双向电泳胶上出现一串水平斑点。虽然该技术不断的发展,依然存在一些不足: 疏水性强及强酸强碱性蛋白质无法用2-DE 进行检测、低拷贝的蛋白质很难被检测到、检测分子量有一定范围、样品上样量相对少使得检测的灵敏度受到限制。而且电泳结果需染色处理，而不同蛋白质与染料的结合差异较大。另外该技术尚不能完全自动化，消耗时间长。

最近发展起来的差异凝胶电泳(Differences gel electrophore-

sis)[9]是将两种蛋白质样品分别用不同的染料进行荧光标记，混合后在一块胶上进行双向电泳。因此，该技术可用于蛋白质的差异鉴定，尤其是用于大样本实验。

②毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE): CE是20 世纪80 年代由Joenson 和Lukacs 提出的高效分离分析技术。即在高电场强度作用下，对毛细管(内径5～10 μm) 中的待测样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离。主要包括毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦和筛板SDS-毛细管电泳。该技术弥补了双向凝胶电泳无法实现自动化分析的不足，并可用于分子量范围不适用于双向电泳样品的检测，对单一样品尤为适用，但对复杂样品的分离尚不完全[10]。

③高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)：HPLC适用于单一蛋白质或简单样品蛋白质组的分离与纯化。它与质谱结合，利用蛋白质等电点、疏水性和分子量的特性进行蛋白质分离鉴定，借助计算机联机检索，实现蛋白质分离鉴定一次完成，能满足高通量、自动化分析的要求。与双向电泳比较，操作简单、速度快且灵敏度高。但由于一维的HPLC仅能分析一些不太复杂的蛋白质体系，而对复杂的多肽混合物常不能满足分离的要求。利用蛋白质不同特性，用多个分离柱对蛋白质进行多次高效液相分离的多维色谱(multi-LC)分离的方法在某种程度上满足了对复杂蛋白质混合分离鉴定的要求，常用于膜蛋白及低丰度蛋白质的分离鉴定[11]。

2.2蛋白质的检测与图像分析

蛋白质样品经双向电泳分离后,首先要经过染色再进行图像分析。常用方法有考马斯亮蓝染色、银染色。考马斯亮蓝染色因简单易行而常用，但灵敏度低。银染的机制是将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银,以使银颗粒沉积在蛋白带上。其灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测小至0.38 ng/mm2的牛血清白蛋白,但操作复杂，动态线性关系不明显，某些蛋白染色不明显甚至不染色。其他的方法也可以在特定情况下使用，包括 [35S]蛋氨酸或14C放射性标记，胶质金、锌咪唑、丽春红、氨基黑及印度红染色等。尽管蛋白质染色方法可以进行蛋白质的定量分析，但不能在一个广泛的浓度、等电点和氨基酸范围内进行蛋白质检测，尤其是对于大量翻译后修饰的蛋白质。

凝胶经过染色并显色后，通过专用扫描仪，将图像扫入计算机内，用特定分析软件进行分析，得到各个蛋白质点的相关数据(pI、分子量、密度等)，然后对感兴趣的蛋白质点进行鉴定。

2.3蛋白质的鉴定

2.3.1肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting, PMF)技术指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后，由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物的质量具有特征性，得到肽片段质量图谱，称为肽质量指纹谱，可用于蛋白质的鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted