蛋白质组学与分析技术课复习思1考
蛋白质组学技术及应用
蛋白质组学技术及应用在生物学研究中，蛋白质组学已经成为一种有效的手段。
因为蛋白质是生命体内最为重要的功能分子，具有复杂的结构，并且在病理发生过程中起着重要的作用。
因此，了解蛋白质的组成和功能，对于认识生物学的本质和疾病的发生机理都至关重要。
蛋白质组学技术的应用范围涉及医学、生物工程、食品科学等众多领域。
一、蛋白质组学技术蛋白质组学技术是基于对生物样品中全部蛋白质的高通量分析，以生成有关蛋白质组成、富集、表达、结构、功能以及相互作用的信息。
蛋白质组学技术通过蛋白质的翻译后修饰、表达水平、相互作用、位置、结构信息等方面研究细胞及生物体系统的生理功能，从而洞悉细胞及生物体系统的机理和事件。
蛋白质组学技术主要分为以下几种：1. 质谱分析技术。
质谱分析是目前最常用的蛋白质组学分析技术。
其主要利用蛋白质的序列和质量来进行分析。
质谱分析技术又包括MALDI-TOF、ESI-Q-TOF、MALDI-TOF/TOF等方法。
通过质谱分析，可以确定蛋白质序列、修饰以及结构信息，并且对于某些代谢异常、蛋白质变异等情况也能进行定量测定。
2. 电泳分离技术。
电泳分离技术是最早的分离方法之一，其基本原理是根据蛋白质质量与荷电性质的不同，利用电场将蛋白质进行分离。
电泳技术主要包括SDS-PAGE、两级荧光差异凝胶电泳以及等电点聚焦电泳等方法。
通过电泳技术，可以测定和比较不同组织、不同生长条件下蛋白质组成的差异。
3. 免疫分析技术。
免疫分析技术是一种非常灵敏的检测方法，其原理是利用蛋白质的免疫特性对蛋白质进行分析。
免疫分析技术主要包括免疫电泳、ELISA、免疫印迹等方法。
通过免疫分析，可以定量测定蛋白质的富集度和表达水平，用于研究生长条件和疾病状态下蛋白质的变化。
二、蛋白质组学技术的应用1. 蛋白质组学在医学中的应用。
蛋白质组学技术可以用于探测对疾病具有敏感性的分子标志物，比如肿瘤标志物、血管生成因子、免疫调节因子等。
并且，通过对样本的蛋白质组成进行分析可以找出疾病的发生机理，并可以利用蛋白质组学技术对药物的疗效及其副作用进行评估。
蛋白质组学与分析技术课复习思1考
蛋白质组学与分析技术课复习思考一、名词解释1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。
二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。
3、三步纯化策略：第一步:粗提。
纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。
去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。
达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析4、高效纯化策略在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。
5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。
如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。
固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。
阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。
其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。
蛋白质工程复习要点
1.定点突变技术：它以单链的克隆基因为模板在一段含有一个或几个错配碱基的寡核苷酸引物存在下合成双链闭环DNA分子。
用该双链闭环DNA分子转入宿主细胞,可解链成两条单链,各自可进行复制,合成自己的互补链,从而可得到野生型和突变型两种环状DNA,分离出突变型基因, 并引入到表达载体中就可经转化利用宿主细胞获得突变型的目的蛋白质。
2.杂合蛋白技术：原理：将不同来源的功能结构域经过组合,产生具有新的生物学功能的杂合多肽举例：鼠源scFv＋大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端3.易错PCR(error prone PCR, EP PCR)：利用低保真度TaqDNA 聚合酶，或者改变PCR 反应体系的条件，在新链DNA 聚合过程中随机引入错配碱基，经多轮PCR 扩增，构建序列多种多样的突变库。
特点：不改变基因长度，突变频率控制在适度范围，能有效地获得有益突变体举例：厌氧菌N. patriciarum 中，木聚糖酶4.DNA 改组技术(DNA shuffling)：原理：先切割产生随机大小的DNA 片段，再用无引物PCR 将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子，最后进行扩增得全长基因举例：α-干扰素5.交错延伸( Stagger extension process)：原理：a.在PCR 反应中把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间(55 →5s)，从而只能合成出非常短的新生链，b.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。
c.此过程反复进行，产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子。
酯酶KCTC1767稳定性和底物耐受性。
6.酶工程：是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学。
研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法。
7.蛋白质工程：通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质更好地造福于人类。
蛋白质组学PPT课件
代谢性疾病蛋白质组学研究通过对糖尿病、肥胖症等代谢 性疾病相关蛋白质的分析，发现了一些与代谢过程密切相 关的关键蛋白质。这些蛋白质涉及糖代谢、脂肪代谢等多 个方面，为药物研发和个体化治疗提供了新的思路和靶点 。同时，对代谢性疾病蛋白质组学的研究也有助于深入了 解疾病的发病机制，为疾病的预防和治疗提供科学依据。
蛋白质组学揭示基因表达 的复杂性
蛋白质组学研究关注基因表达的最终产物蛋白质，揭示了基因表达的复杂性和多样性 。蛋白质的表达和功能受到多种因素的影响 ，如翻译后修饰、蛋白质相互作用等，这些
因素在基因组学研究中难以全面考虑。
蛋白质组学与代谢组学的关系
代谢组学为蛋白质组学提供上下文
代谢组学研究生物体内小分子代谢物的变化，为蛋白质组学提供了上下文和背景。蛋白 质的功能和表达往往与代谢物的变化相互关联，了解代谢物的变化有助于更深入地理解 Nhomakorabea02
蛋白质组学研究技术
蛋白质分离技术
双向凝胶电泳技术
通过改变电泳的pH值和电场强度， 将复杂的蛋白质混合物分离成多 个有序的蛋白质带，以便后续的 鉴定和分析。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在固相支持物上， 通过与特定的配体或抗体相互作 用，实现对蛋白质的快速、高通 量筛选和检测。
蛋白质免疫沉淀技
术
利用抗体与目标蛋白质的特异性 结合，将目标蛋白质从复杂的混 合物中分离出来，常用于蛋白质 相互作用的研究。
详细描述
癌症蛋白质组学研究通过对癌症细胞和正常细胞蛋白 质表达谱的比较，发现了一系列与癌症发生发展相关 的关键蛋白质。这些蛋白质涉及细胞信号转导、细胞 周期调控、细胞凋亡等多个方面，为癌症治疗提供了 潜在的药物靶点。
案例二：神经退行性疾病蛋白质组学研究
蛋白质分析和蛋白质组学
2010 郝大鹏
模体的意义
• 总结：一些简单而常见的模体在一组蛋白质中发 现并不意味着这组蛋白质是同源的（跨膜区结构 域或磷酸化位点）。
• 在另一些情况下，模体可以成为一个蛋白质家族 的标志，反映了这个家族的亲缘关系。可以利用 这个族徽寻找宗亲。（载脂蛋白超家族）
• 被磷酸化的丝氨酸和苏氨酸在不同蛋白质中处于不同的模 体中。组蛋白中为SP##(#为带正电的氨基酸)。蛋白激酶 PKA或PKG中的模体是##X[S/T]。
2010 郝大鹏
Motif与细胞定位
2010 郝大鹏
蛋白质细胞定位的模体
• 当C端的4个氨基酸序列为KDEL或HDEL时， 蛋白质就被局限在细胞的内质网中
水解实验，可以看出结构域能组成一个结构单元。 • 结构域常由不同的外显子编码。
2010 郝大鹏
总结
• 结构域的概念：从最初的一级结构中较长的重复片段，上 升为有特征的立体结构，而且他们有一定生物功能，并且 对应着基因中的某些外显子，为它们编码、形成肽链后， 还能自行折叠成稳定的结构。总之，结构域可看作是一个 “entity”。
2010 郝大鹏
蛋白质模式的种类
• 特征(signatures)的概念很宽广，它确定一个蛋白 质分类，可能指结构域(domain)、家族(family) 或模体(motif)。signature主要可以分为两类：
结构域(domain)是蛋白质中能折叠成特定三维结构的 一段区域。结构域也能被称为模块。一组拥有相同结 构域的蛋白被称为一个蛋白质家族。
蛋白质组质谱分析技术2010一质谱仪是质谱分析技术的重要科学实验仪器质谱仪massspectrometerms是利用电磁学原理使离子按照质荷比进行分离从而测定物质的质量与含量的科学实验仪器一般由进样器离子化源质量分析器离子检测器控制电脑及数据分析系统组成其中样品入机的离子化源和测量被介入离子分子量的质量分析器是两个关键的部件
蛋白质组学复习重点
蛋白质组学复习重点1.名词解释(掌握名词的中英文)1、蛋白质组（proteome)是指一个基因组、一种细胞或组织表达的所有蛋白质。
2、蛋白质组学 Proteomic蛋白质组学是通过大规模研究蛋白的表达水平变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究，是生命科学研究的热点领域之一。
3、电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）电喷雾离子化是在质谱系统离子源毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。
4、噬菌体展示技术 (phage display technology)一种将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
5、双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）指的是按照蛋白质的两个性质即“等电点”和“分子量”进行二维电泳分离。
过程主要是先进行等电聚焦电泳，按照等电点分离，然后再进行SDS-PAGE，按照分子大小分离，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
6、等电点（isoelectric point）在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH 称为该氨基酸或蛋白质的等电点。
7、质谱分析（mass spectrometry，MS）MS是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。
8、生物信息学（bioinformatics）生物信息学是综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义的新兴交叉学科，包含了生物信息的获取、处理、存储、发布、分析和解释等在内的所有方面。
蛋白质组学技术的原理和应用
蛋白质组学技术的原理和应用随着科技的不断发展，蛋白质组学作为现代生命科学领域的重要分支逐渐崭露头角，成为了研究人员分析蛋白质结构、功能和相互作用的重要方法之一。
那么，蛋白质组学技术到底是什么，它又如何应用呢？一、蛋白质组学技术的原理所谓蛋白质组学技术，就是通过基于质谱分析和生物信息学原理的高通量分析方法，快速、高效地检测、鉴定和定量蛋白质样品中的成分、数量和相互作用等基本信息，进而揭示蛋白质在生命体内的功能和代谢等生物学特性。
其基本原理可以概括为以下三个步骤：（1）样品前处理：包括样品提纯、酶解、标记和纯化等处理，以获得符合质谱检测要求的样品。
（2）质谱分析：选择适当的仪器和方法，进行样品分析和蛋白质结构、功能等特性的检测和定量。
（3）生物信息学分析：通过大数据处理、数据库搜索和功能注释等方法，对质谱分析数据进行解读和分析，进而获取蛋白质相互作用、信号传递、代谢途径等生理特性的信息。
二、蛋白质组学技术的应用蛋白质组学技术的应用涵盖了广泛的生命科学领域，例如：1. 疾病诊断和治疗蛋白质组学技术可以检测和鉴定体内的蛋白质变化，发现与疾病有关的标志物、生物学特性和药物靶点等。
可应用于疾病的诊断、预后预测和治疗。
2. 食品和环境安全蛋白质组学技术可以用于鉴别和检测不同来源的食品、环境污染物等材料中的特定蛋白质成分和污染物类型，实现快速准确的定性和定量分析。
3. 新药开发蛋白质组学技术可以帮助药物的筛选和开发，检测药物分子与蛋白质分子之间的相互作用，预测药物的毒副作用和有效性，优化药物的种类和剂量等。
4. 基础研究蛋白质组学技术应用于蛋白质结构、功能和代谢等方面的基础研究，有助于揭示蛋白质在细胞、组织和器官等不同层次上的生理活动及其调控机制，为进一步研究人类疾病、生物进化和生物多样性等提供重要支持。
三、蛋白质组学技术面临的挑战尽管蛋白质组学技术具有广泛的应用和发展前景，但其面临的挑战也很多，包括：1. 样品前处理的复杂性和标准化难度。
生物考试分析与反思5篇
生物考试分析与反思5篇生物考试分析与反思篇1生物已经复习了二周，感到学生的基础知识和以前相比，有了一定的提高。
首先一定要重视课本基础知识的复习，以课本为基础的基础知识复习时，注重知识的全面性，稳扎稳打，俗话说：基础不牢、地动山摇。
因此，在复习时注意把零散的知识串联起来，使学生在脑海中把知识点间的内在联系形成清晰的网络，学生在理解的基础上印象会更深，能提高学生的综合分析能力。
比如在讲解动脉血和静脉血时，和学生一起总结出肺动脉中流静脉血，肺静脉中流动脉血，体动脉中流动脉血，入球小动脉和出球小动脉中都流动脉血。
其次要重视重点和难点的复习，突破重点、攻破难点是复习的重要策略，因此，在复习过程中要集中精力和时间加以学习理解和掌握，对知识的要点通过优化设计、强化训练、总结规律和要点，使学生容易记忆，达到事半功倍的效果。
所以在复习人体内物质的运输时和学生一起体循环和肺循环时，我们在一起找窍门，怎样熟记，怎样找其中的规律，比如说，体循环和肺循环都是从心室射血。
()流向动脉血管，在流向身体的各器官，流回静脉，回到心脏的心房，找到规律之后，在理解体循环和肺循环就好多了。
在比如和学生一起找窍门，比如发生气体交换的场所是全身的毛细血管网或者肺部的毛细血管网，血液的成分发生了变化，所以和学生总结出规律后，比较容易去理解问题。
总之，在复习的时候一定要做到查漏补缺，对知识进行巩固。
生物考试分析与反思篇2新课程改革在我校进行一年多以来，它将老师与学生从题海战术中真正的解脱出来，由主要强调关注知识本位到关注学生的个性化发展及终身发展，这是一个巨大的飞跃。
作为一名称职的高中生物教师，在教学中决不能“照本宣科”，要转变教学观念要，强化教师素质，还要不断的反思自己在教学中的不足，并及时改正。
笔者就新课改一年多以来的高中生物教学谈谈自己的几点看法。
1.认真领悟教材，做好模块设计的设计者。
新课程改革将高中生物分为三大必修模块，即《分子与细胞》、《遗传与进化》、《稳态与环境》;三大选修模块，即《生物技术实践》、《生物科学与社会》、《现代生物科技专题》。
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蛋白质组学与分析技术课复习思考一、名词解释1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。
二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。
3、三步纯化策略：第一步:粗提。
纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。
去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。
达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析4、高效纯化策略在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。
5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。
如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。
固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。
阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。
其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。
离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。
6、吸附色谱吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。
7、PCR扩增PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。
进而推断出因序列的情况下使用。
PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补；3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。
典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。
8、基因组文库基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。
广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。
狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。
基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。
9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。
这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。
而从mRNA 出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。
10、基因芯片基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。
是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。
将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。
11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。
对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。
12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。
同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。
同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。
同源性更小时，从无到有法更有效。
一级序列――搜索数据库中已有结构的同源序列（或者结构域）――挑选模板蛋白――序列和结构配比――模建保守区域――模建环区――模建侧链二、简答题1．蛋白质组学主要包刮那些分析技术及各自特点内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。
分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳；蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。
2.蛋白质组研究的技术路线流程图3.蛋白样品的制备原则与纯化原理一、实验样品的制备原则1)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
2)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
4)完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
二、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法：透析和超过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH，不同蛋白在各自pI处依次沉淀。
2.盐溶和盐析：3.有机溶剂分级分离法（三）蛋白质的沉淀1．可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷，Pr结构和性质没有变化，适当条件下可重新溶解。
——非变性沉淀。
pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
2．不可逆沉淀：强烈沉淀条件，破坏Pr胶体溶液稳定性，也破坏Pr结构和性质，沉淀不能再重新溶解。
——变性沉淀。
如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等。
4.简述高效液相色谱、气相色谱、质谱、液质联仪的工作原理及用途1）高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
主要应用于氨基酸分析、肽和蛋白质的分离分析及糖类的分析，还包括蛋白质的分离纯化、氨基酸组成分析（氨基酸标本，N端测序）、蛋白质酶切肽段的分离、注入质谱后进行蛋白质组学的分析、样品纯度的粗鉴定。
2）气相色谱：3）质谱：质谱现象的就是不同电荷Z和质量m的各种离子碎片的质量（严格地说应是质量对电荷的比值，质荷比m/z），这些质荷比并不直接给出有关离子结构的信息，但是质核比不同的离子碎片的种类及其相对含量与试样分子的组成和结构有关。
通过对质谱的分析（试样分子可能产生的各种离子碎片分析）和根据已知的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的结构、组成及其分解历程。
在生物蛋白质中，目前质谱分析能解决的主要问题是测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链中氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。
质谱分析是解决核酸一级结构测定的最有利手段之一，包括分子量测定、核酸的序列分析；同时利用质谱测定寡糖和多糖的结构。
4）液质联用（HLPC-MS）：以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
蛋白质样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。
可以对每一个肽段进行序列分析，综合所有MS数据来鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。
5.高效液相色谱有哪些主要特点它的分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂混合物的分离；它的应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成物质，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。
可以说几乎包括了所有类型物质；它可以根据分离对象，按不同分离机理，广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数；它即是精细的分离纯化方法，也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段；它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量，可以实现在线检测和自动化操作。
6.怎样进行蛋白质和多肽的氨基酸序列测定1.蛋白质的N端测序固相Edman降解是将蛋白质和多肽通过共价偶联在惰性载体上,因而蛋白质与多肽样品与多余的反应试剂以及切割后产生的氨基酸衍生物的分离就非常容易。
具体步骤：1）采用常规的SDS-PAGE方法，凝胶浓度通过前期的实验确定，电泳方法按照Laemmli方法进行.2）电印迹实验：将蛋白质印迹转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，然后将此PVDF膜片放入测序仪的反应室进行Edman降解。
最近，PE／ABI公司推出的配备毛细管HPLC的Procise—CLC型序列仪，PTH氨基酸检测的灵敏度可达0.1p mol。
3）根据各个氨基酸的色谱图与标准氨基酸图谱的对照，可以按顺序测定氨基酸的种类，从而得到蛋白质序列。
4）测序单位根据所提供样品的数量测定了N端的15个氨基酸的序列，足以用来进行PCR 引物的设计。
2.运用质谱进行肽段序列测定测序时，先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)和SV8酶(staphylococcus aureus V8)等。