泸型酒中层酒醅真菌群落的发酵演替规律_肖辰
泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展
基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0400501-05）；四川省科技计划项目（2016CC0032）。
收稿日期：2020-12-03作者简介：张宿义(1971-)，男，博士，正高级工程师，中国酿酒大师，研究方向：微生物与发酵领域。
通讯作者：熊燕飞（1981-），女，工程师，硕士，研究方向为酿酒科技管理。
DOI ：10.13746/j.njkj.2020266泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展张宿义1，2，刘淼1，2，沈才洪1，2，林锋1，2，罗惠波1，2，侯长军1，2，熊燕飞1，2，杨艳1，2，李德林1，2（1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000； 2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）摘要：窖泥中含有大量的功能微生物，其作为白酒生香功能微生物的繁殖载体，在泸香型白酒的生产过程中发挥了重要作用。
窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素，目前基于传统微生物技术和现代生物学技术（如以聚合酶链式反应（PCR ）技术、基因组学技术、高通量测序技术）等对白酒窖泥微生物的研究，已经取得了丰富的研究成果，检测到越来越多的窖泥微生物，发现微生物多样性越来越高。
本文综述了窖泥微生物群落结构的多样性、窖泥功能微生物对白酒风味的贡献、新老窖泥中无机成分的质量评价，并针对研究存在的问题提出未来研究方向：进一步发掘窖泥微生物资源，提升功能微生物的应用潜力，以期为白酒生产中遇到的实际问题提供理论指导。
关键词：泸香型白酒；窖泥；微生物群落；功能多样性；质量评价；研究进展中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2021）01-0071-06Research Progress in Microbial EcologicalFunction in Pit Mud of Nongxiang BaijiuZHANG Suyi 1,2,LIU Miao 1,2,SHEN Caihong 1,2,LIN Feng 1,2,LUO Huibo 1,2,HOU Changjun 1,2,XIONG Yanfei 1,2,YANG Yan 1,2and LI Delin 1,2(1.Luzhou Laojiao Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;2.National Engineering ResearchCenter of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China)Abstract :Pit mud contains large amounts of functional microbes,which are of great importance in the production of Nongxiang Bai-jiu.Microbes in pit mud are the key factors determining the style of Nongxiang Baijiu.In recent years,the researches on the microbes in pit mud based on traditional and modern biological technologies,such as PCR,genomics,and high-throughput sequencing,have gained significant achievements:more and more microbes in pit mud have been detected,and the microbial diversity was proved high-er with each finding.In this paper,we reviewed the diversity of microbial community in pit mud,the contribution of functional mi-crobes to the flavor of Baijiu,and the quality evaluation of inorganic components in new and old pit mud.Then,the existing problems were analyzed,and the research prospects were put forward:further exploring the microbial resources in pit mud,and enhancing the application potential of functional microbes.This study has provided theoretical guidance for solving the practical problems in Baijiu production.Key words :Nongxiang Baijiu;pit mud;microbial community;functional diversity;quality assessment;research progress白酒是世界六大蒸馏名酒之一，由于白酒的酿造工艺不同和地理环境的差异，形成了多种香型的白酒，泸香型白酒(又被称作浓香型白酒)产量及市场份额占据整个白酒行业的70%左右[1]，浓香型白酿酒科技2021年第1期（总第319期）·LIQUOR -MAKING SCIENCE &TECHNOLOGY 2021No .1(Tol .319)71酿酒科技2021年第1期（总第319期）·LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2021No.1(Tol.319)酒以粮谷为主要原料，利用中高温大曲为糖化发酵剂，采用泥窖固态法发酵，经蒸馏、陈酿、勾兑而成，具有绵柔甘洌、芳香浓郁、香味协调等特点。
不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析
不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析中国白酒的酿造过程是个复杂的自然多菌种固态发酵过程,在从谷物原料到白酒的发酵历程中,不仅涉及到酒曲中的微生物,同样集成了多种环境中的复杂微生物种群。
因此,白酒发酵微生态应包含发酵过程微生态与发酵环境微生态。
然而目前对于发酵环境微生物种群结构及其对发酵过程的影响尚且没有系统的研究。
本研究选择典型的清香类型白酒生产过程,利用相同的大曲和发酵工艺,在老厂区及新厂区两个不同环境中同时进行两批比较性发酵研究,结合多相代谢物靶标分析、高通量测序和微生物溯源分析方法,系统分析了清香类型白酒发酵环境微生物组成结构、白酒发酵微生物的来源及环境微生物变化对白酒发酵的影响。
此外,由于大曲的制作工艺同样是自发式固态发酵过程,因此本研究进一步分析了环境微生物对大曲微生物种群结构的影响。
主要研究内容如下:（1）采用多相代谢物靶标分析不同酿造环境下酒醅中微生物代谢规律,发现环境改变会导致酒醅风味物质代谢图谱发生变化。
从酒醅中共检测到58种代谢物,包括4种醇类、10种酸类、27种酯类、11种芳香族化合物和6种其他物质。
通过对老厂区及新厂区两个典型酿造环境下的白酒发酵过程研究,发现新厂区酒醅与老厂区酒醅的代谢图谱有明显差异,主要体现在发酵结束时老厂区酒醅中乙醇含量(99.97±13.05 g?kg<sup>-1</sup>酒醅)显著（p<0.01）高于新厂区酒醅中乙醇含量(37.57±3.44g?kg<sup>-1</sup>酒醅),同时老厂区酒醅中总酯、总醇、总芳香族化合物含量均高于新厂区。
但是新厂区酒醅中总酸含量高于老厂区,主要包含乙酸、乳酸和苹果酸。
（2）通过高通量测序技术比较新厂区酒醅及老厂区酒醅中微生物种群演替规律,发现不同环境酒醅初始微生物种群结构不同,进一步造成酒醅中微生物演替规律及代谢的差异。
白酒固态酿造中酵母种群结构和生态环境多样性变化规律的研究进展
3环境对酵母的影响
环境的改变会导致酒醅中初始微生物结构的差 异，进而导致微生物种群演替差异，其中酵母的种 群结构也会受到影响。 3.1高温环境
对于酵母耐热机制的研究，早期主要集中在 比较生物学上。酵母质膜的流动性在高温下会受 到影响。当温度太高时会造成膜紊乱以及造成蛋 白质的变性，抑制糖酵解并增加突变。同时，质 膜的渗透性得到增加，从而质子流增加。高温对 酵母细胞也有。温度越高，越容易引起酵母过早 衰老和死亡，从而使细菌占主导地位。温度通常 会导致酵母细胞中各种成分的变化，例如脂肪酸、 磷脂、麦角固醇等。 3.2低温环境
高通量测序技术是可以进行深刻而透彻测序的 下一代测序方法，可以同时分析几十万到几百万个 DNA分子的序列，通常是非常短的长度，允许对一 个物种的转录组和基因组进行精确深入的研究。当 前这种测序技术设计出了第二代和单分子测序技 术，主要是 Roche 454的GSFLX平台，ABI的 SOLID 测序平台和 Illumina 的 SolexaGenomeAria。
2酵母种群主要研究方法
2.1传统分离培养法 传统分离培养法中最常见的是微生物平板培养
法。该方法是利用营养成分不同的固体培养基分离 培养可培养的微生物，并根据菌落的数量和形态确 定微生物的数量和类型。分离和培养微生物的平板 稀释法是最普遍的操作之一，通常分为稀释、接 种、培养、计数几个阶段。但该方法存在许多不 足，比如在选择固体培养基和实验室培养条件上都
浓香型白酒主要发酵产物生成与微生物类群的动态变化_余有贵
收稿日期：2011-09-30 基金项目：邵阳市科技计划项目(C1142；C1021)；湖南省科技计划项目(2009NK3120) 作者简介：余有贵(1964 —)，男，教授，博士，研究方向为发酵技术与酶制剂的应用开发。E-mail：yufly225@
※生物工程
食品科学
2012, Vol. 33, No. 01 171
The main fermentation products in the lower fermented grains were higher than the counterparts in the upper fermented grains.
The relative variation ranges in the numbers of different species of microbes decreased in the following order: yeast > bacteria ＞fungi.
上层粮糟醅与下层粮糟醅的总酸含量整体变化趋势 相同，但下层糟醅总酸含量略高于上层糟醅的总酸含 量，主要是发酵产生的黄水将上部醅产生的酸下沉扩散 到窖池下部醅中积累所致。 2.3 粮糟发酵过程中乙酸、丁酸与己酸含量的变化
酸含量 /(mg/100mL)
40
上层样乙酸 下层样丁酸
35
下层样乙酸 上层样丁酸
4.0
下层样
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 7 14 21 28 35 42 49 56
发酵时间 /d
图 4 粮糟发酵过程中总酯含量的变化 Fig.4 Changes in total ester content of fermented grains during
传统白酒发酵过程中微生物种类及功能研究进展
传统白酒发酵过程中微生物种类及功能研究进展赵龙飞;周文和【摘要】The microbial species affected the formation of liquor quality and yield during the process of fermen-tation. Taking microbial four categories as clues, we discussed the effect of microorganisms on liquor quality for-mation. It provided ideas for using microbiology to improve liquor quality , laid the foundation for liquor practice production.%发酵过程中的微生物种类影响白酒品质的形成和产量高低,着重从四大类微生物(酵母菌、霉菌、细菌、放线菌)角度,探讨发酵过程中微生物对白酒品质形成的影响,旨在为利用微生物改良白酒品质提供思路,为白酒生产奠定基础.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)019【总页数】4页(P195-198)【关键词】白酒;发酵;微生物;酵母菌;霉菌;细菌;放线菌【作者】赵龙飞;周文和【作者单位】商丘师范学院生物与食品学院,河南商丘476000;河南林河酒业有限公司,河南商丘476000【正文语种】中文Abstract：The microbial species affected the formation of liquor quality and yield during the process of fermentation.Taking microbial fourcategories as clues，we discussed the effect of microorganisms on liquor quality formation.It provided ideas for using microbiology to improve liquor quality，laid the foundation for liquor practice production.Key words：liquor；fermentation；microorganisms；Saccharomycetes；Mould；Bacterium；Actinomycetes白酒酿造在我国具有悠久历史，传统白酒主要是蒸馏酒[1]，以高淀粉质原料为发酵基质，以传统酒曲为糖化剂，采用固态、半固态或液态发酵方式，经蒸馏、陈化和调勾而成含酒精的饮品，被列为世界著名蒸馏酒之一。
浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究
浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究一、本文概述白酒，作为中国独特的传统酒类产品，其酿造过程中涉及到众多复杂的微生物群落。
其中，窖泥作为白酒发酵的重要载体，其微生物群落的结构和多样性对于白酒的质量和风味具有重要影响。
在浓香型白酒的生产过程中，梭菌群落是窖泥微生物群落的重要组成部分，其多样性与窖泥质量之间的关系研究，对于提高浓香型白酒的生产效率和产品质量具有重要意义。
本文旨在深入研究浓香型白酒窖泥中梭菌群落的多样性，以及其与窖泥质量之间的关联性。
通过对不同窖泥样品中梭菌群落的分析，揭示梭菌群落多样性对窖泥质量的影响机制，为优化浓香型白酒的生产工艺和提高产品质量提供理论支持和实践指导。
研究内容包括窖泥样品的采集和预处理、梭菌群落的分子生物学鉴定、群落多样性分析、以及梭菌群落多样性与窖泥质量之间的相关性分析等。
采用现代分子生物学技术，如高通量测序和生物信息学分析，对窖泥中的梭菌群落进行全面、系统的研究。
通过本文的研究，有望为浓香型白酒的生产提供新的理论依据和技术支持，推动白酒产业的可持续发展。
对于深入理解白酒酿造过程中的微生物生态学原理，也具有重要的科学价值。
二、材料与方法选择位于不同地理位置、具有不同酿造历史和风格的多个浓香型白酒窖池，在窖池的不同深度（表层、中层、深层）采集窖泥样品。
采样过程中确保窖泥样品不受到外界污染，如雨水、尘土等。
使用的主要试剂包括DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、梭菌特异性引物等。
主要仪器包括离心机、PCR仪、凝胶成像系统、高通量测序仪等。
将采集的窖泥样品进行冷冻干燥，研磨成粉末状，并过筛去除大颗粒杂质。
然后按照DNA提取试剂盒的说明提取窖泥中的微生物总DNA。
使用梭菌特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物经过纯化后，利用高通量测序仪进行测序。
测序数据经过质量控制和拼接后，得到每个样品的梭菌群落信息。
利用生物信息学软件对测序数据进行分析，包括OTU聚类、物种注释、群落结构分析等。
浓香型白酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析
四川大学硕士学位论文浓香型白酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析姓名：吴飞申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：胡承20060501１．２总ＤＮＡ的纯度对于纯净的ＤＮＡ样品。
在波长２６０ｈｍ和２８０ｈｍ的吸收量之比（Ａｂｓ２６０／Ａｂｓ２８０）应为１．８０。
本实验中的几个ＤＮＡ样品，通过紫外吸收分光光度测定法测出的Ａｂｓ２６０／Ａｂｓ２８０值都在１．７～１．８之间，表明所提ＤＮＡ都具有较高的纯度，不经进一步纯化即可进行下一步的ＰＣＲ扩增反应。
图１．６个菌株的基因组ＯＡＮ提取结果Ｍ：＾－ＨｉｎｄｌｌＩｄｉｇｅｓｔｌ：德巴利酵母２：假丝酵母３：毕赤酵母４：汉逊酵母５：伊萨酵母６：红酵母２．１８５ｒＤＮＡ片段的ＰＣＲ扩增及纯化２．１ＰＣＲ扩增结果图２．６个菌株的１８￥ｒＤＮＡ扩增结果Ｍ．＾－ＨｉｎｄＩＩＩｄｉｇｅｓｔ１．－德巴利酵母２：假皇圣酵母３：毕赤酵母４：汉逊酵母５：伊萨酵母６：红酵母４３婴型查兰竺主兰堡堡塞以ＥＦ３、ＥＦ４为引物，９５℃预处理５ｍｉｎ、９５℃热变性ｌｍｉｎ、船℃退火ｌｍｉｎ、７２。
Ｃ延长２ｍｉｎ，共３５个循环对６株酵母进行扩增，得到的结果如图２所示。
从图上可以看出，以上述条件进行扩增，均能得到较好的扩增结果，目的片段的浓度都非常大。
但是，图上显示扩增结果中有一些非特异性条带，另外还有一些引物二聚体存在。
需要对此ＰＣＲ产物进行进一步纯化。
２．２ＰｅＲ产物的纯化采用ＰＣＲ产物纯化试剂盒对ＰＣＲ产物进行纯化，其结果见图３。
从图上可以看出，经过纯化，小片段的非特异性扩增片段和引物二聚体基本上被完全除去，与目的片段长度相近的片段也得到一定的稀释。
表明此种纯化效果较好，纯化后的产物可以用来进行下一步的试验。
图３．Ｐ僳产物纯化后的电泳结果Ｍ：＾－ＨｉｎｄＩＩＩａｉｇｅａ１：德巴利酵母２：假丝酵母３：毕赤酵母４：汉逊酵母５：伊萨酵母６：红酵母３。
ＰＣＲ产物的克隆３．１滞后现象的检查将ＰＣＲ纯化产物与ＰＴ７一Ｂｌｕｅ载体连接，转化大肠十ｒ菌感受念细胞，挑选婴！！！查兰堡±兰竺丝苎在ＬＢ筛选培养基上生长的白色菌落抽提质粒，电泳检测其滞后现象。
白酒酿造中的微生物分析与调控研究
白酒酿造中的微生物分析与调控研究白酒是中国传统的名优特产，已有几千年的历史。
作为全球最大的酒类市场，中国市场的白酒消费占了相当大的份额。
白酒的酿造过程中，微生物起着至关重要的作用，其中的微生物分析与调控研究一直是白酒酿造研究的热门领域之一。
白酒的酿造过程主要包括酒曲发汗、酒糟发酵、白酒蒸馏、熟成等多个步骤。
而其中微生物的生长、代谢和转化，直接关系到白酒口感、香味、质量等方面。
首先，在白酒酿造的第一步酒曲发汗过程中，曲霉与麸皮中的符杆菌、真菌等微生物生长、代谢和转化，形成典型的曲霉味和特有的黄麹花香味。
研究表明，这些微生物的表现会直接影响到酵母的发酵性能，并影响到后续步骤的酒质、口感等方面。
其次，在白酒酿造的第二步酒糟发酵过程中，乳酸菌、酵母和辅料中的微生物共同合作，产生大量的酒精和其他有机酸，同时生成酱香型、米味型等口感特点。
微生物的代谢特性也会对酵母发酵性能直接影响，从而影响到白酒口感的丰富性和独特性。
最后，在白酒酿造的最后一步熟成过程中，微生物的发挥与作用依然不可忽视。
如富含亚油酸和芝麻酸的嗜酸乳杆菌、乳酸杆菌、酵母菌等，在熟成过程中会不断地进行代谢和转化，产生各种有机物，同时也会对白酒的氧化、降酸、降苦和防腐等方面发挥作用。
因此，白酒中微生物的分析与调控研究变得极为重要。
随着科技的不断进步，高通量测序、蛋白质组学、代谢组学等技术的应用，使得对白酒微生物群落的研究更加深入和准确。
例如，通过对曲霉集合体的基因组学分析，可以研究其代谢途径和功能基因等，为曲霉的优化调控提供了可靠的理论基础。
除了分析微生物群落结构，研究者还需要对微生物的种类、数量、代谢特性等进行准确地评估，以便为酒曲配制、酵母的筛选和优化等提供科学依据。
同时，通过特定的调控方法和方案，如添加益生菌、调节酸度、增加氧化时间等，也可以对微生物的作用进行有效控制，优化酒质、口感等方面。
在微生物的分析与调控方面，传统的经验不再适用，必须彻底了解微生物群落的组成和特点，灵活运用现代科技手段，才能使白酒在保持中国特色的同时，更好地适应社会和市场的需求。