现代食品微生物学实验土壤中微生物分离纯化和菌相分析 上海海洋大学 硕士课程 宁喜斌 欧杰共29页共3
《现代食品微生物学》 第三章 微生物计数 上海海洋大学 硕士课程 宁喜斌
第三章微生物计数
倾注法
涂布法
二、最大可能数法
最初样品中微生物数量通过查阅表MPN表获得，这实际上是统计学上的一种方法，通常MPN法的结果高于SPC的结果。
优点：1.方法简单
2.与SPC法比较，不同实验室得到的结果更加可靠，相似率较高
3.特殊微生物群体可以通过适当的选择性培养基进行测定
4.大肠菌群的测定
缺点：玻璃皿使用量大，且缺乏观察微生物菌落形态的机会，精确度低。
三、染色还原计数
在估测相关产品中活菌数量时，通常使用两种染色体：亚甲基蓝（methylene，美蓝）和刃天青，在进行染色还原试验时，食品上清液加入染色剂标准溶液。
亚甲基蓝：蓝色→白色
刃天青：暗蓝色→粉红色或白色
染色剂还原的时间与样品中微生物的数量成反比。
优点：1.染色还原技术很早就应用于乳品场中，用它来估测鲜牛乳的微生物数量
2.具有简单、快速、经济等优点
3.只有活细胞才对染色剂有明显的还原能力
缺点：1.不同微生物对染色剂的还原程度不同
2.不适用于含有还原酶的食品，除非使用特殊的方法处理样品
四、显微镜直接计数法（DMC）
将食物样品在载玻片上涂布或在载玻片上培养；用适当染色剂染色；显微镜计数或菌落计数。
广泛用于乳品厂，也可用于干燥食品和冷冻食品的微生物快速监测。
优点：快速、简便、可以观察细胞形态
缺点：1.易造成操作人员疲劳
2．死细胞亦计算在内，食品颗粒可能不能与微生物区分，单细胞和菌落可能无法区分清楚
3.有些细胞染色不好可能不被计入
4.DMC法比SPC结果值高。
土壤中的微生物分离纯化和菌相分析
（二）平板划线分离法
1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很 多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。
划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。
二、实验原理
三、实验器材
1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素 乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌 素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。
二、实验步骤（方法一）
1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上振 荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试管 菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管中， 此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍 数。
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪 9董天涵 8怡菲 8逄颖 5【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
土壤微生物的分离和纯化
土壤微生物的分离和纯化土壤微生物的分离和纯化一、实验目的1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。
3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。
二、实验原理土壤是微生物生长和栖息的良好基地。
土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。
因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。
链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。
加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。
重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。
三、实验器材1、材料：10cm左右深层土壤。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH 试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。
四、实验步骤1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。
2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。
然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－3、10－4、10－5、10－6、10－7 稀释度的土壤稀释液。
3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。
灭菌后分别倒3个平板。
（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素）4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。
细菌选用10－4、10－5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪 9董天涵 8怡菲 8逄颖 5【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。
王--实验二 土壤中微生物的分离与纯化
王--实验二土壤中微生物的分离与纯化
土壤中是存在大量微生物的，包括细菌、真菌、放线菌等，在生态系统中起着重要作用。
微生物的分离与纯化是微生物学研究的重要方法之一，对于了解土壤微生物多样性、功能和应用具有重要意义。
本实验旨在通过土壤样品进行微生物分离和纯化，了解微生物分离技术和分离纯化菌株的方法。
一、实验方法
1.1 实验设备
实验室常用的分离纯化设备有平板计数器、减压灭菌器、烧杯、移液器、离心机等。
其中，平板计数器是精确测定细菌数量的仪器。
实验材料包括培养基、细菌液、土壤样品等。
1.3 分离纯化细菌的步骤
（1）将土壤样品放入离心管内。
（2）在土壤样品中加入生理盐水，摇晃离心管，使土壤样品和生理盐水充分混合。
（3）将混合物在烧杯内振荡。
（4）利用平板计数器精确测定细菌数量。
（5）从混合物中挑出单个菌落，进行菌株分离和纯化。
（6）将菌落移至培养基上，进行培养、观察和记录。
二、实验结果
通过本实验，我们共采集了5个不同土壤样品，进行菌落计数和菌株分离、纯化、培养等处理。
实验结果显示，不同土壤样品中微生物的数量和种类存在差异。
其中，含有腐殖质较多的土壤样品中微生物数量较多，且种类丰富。
2.2 结果分析
土壤微生物数量和种类的差异主要与土壤样品的营养含量及物理化学性质有关。
白灰土、黄土、红壤等含有较高营养含量和较优地理环境的土壤样品中微生物的数量和种类较多，而贫瘠荒芜的土壤样品中微生物数量和种类较少。
此外，氧分压、pH值、盐分等土壤环境因素的差异也会导致土壤中的微生物数量和种类存在差异。
实验 土壤中细菌的分离与纯化
四、操作步骤（1）
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 制备土壤稀释液 涂布平板 培养 挑菌落 平板划线分离 转入斜面 观察菌落特征、制片镜检菌体形态 菌种保藏
四、操作步骤（2）
1. 制备土壤稀释液
四、操作步骤（3）
2. 涂布
四、操作步骤（4）
3. 培养：高氏Ⅰ号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置
实验十
微生物的分离与纯化
一、目的要求
1. 掌握土壤微生物的分离纯化方法和无菌操作 技术； 2. 初步掌握微生物的鉴定技术。
二、实验原理
1. 自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研 究某种微生物的特性，首先须使该微生物处 于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得 只含有某一种或一株微生物的过程称为微生 物的分离与纯化。
于28℃培养箱中培养3~5 d，牛肉膏蛋白胨培养基平板 倒置于37℃培养箱中培养2~3 d。
四、操作步骤（5）
4. 挑菌落
接种和分离工具
1. 接种针；2.接种环；3.接种钩；4.5.玻璃涂棒；6.接种圈；7.接种锄；8.小解剖刀
四、操作步骤（6）
5. 平板划线分离
四、操作步骤（6）
平板划线法
平板划线分离的方法
2. 土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离 到很多有价值的菌株。本实验将采用三种不 同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
三、实验器材
1. 土样：采集校园土壤
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基——细菌 高氏Ⅰ号培养基——放线菌 马丁氏培养基——真菌 3. 其他：无菌的培养皿、盛90mL无菌水并带 玻璃珠的三角瓶、盛9mL无菌水的试管、小 铁铲、吸头、移液器、无菌玻璃涂棒、接种 环、显微镜、染色液等。