干扰素的功能、制备方法和工艺的研究

干扰素的功能、制备方法和工艺的研究2008级生物技术邓君 082101108摘要本文在查询大量文献，由作者归纳整理得出了关于干扰素的功能、制备方法和工艺的一些新的理论和实际应用。

更好的了解了干扰素的作用机制以及对人类社会的重要用途。

关键词干扰素，功能，禁忌症，生产过程，制备工艺前言干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物活性的蛋白质，在疾病诊断预防和治疗中有重要价值，受到医学界、生物界的极大重视，传统的从动物中提取血源性干扰素由于来源有限及技术资金方面问题而无法大量合成已经是过去了，随着生物技术的发展，通过先进的DNA重组技术，可以在人体外大规模生产干扰素，基因工程干扰素具有无污染，安全性高，纯度高，比活性高，成本低，疗效确切等优点。

如今临床应用的需求量越来越高，如何使基因工程干扰素大规模产业化生产成为了重要课题。

想要推广干扰素的使用，必须建立高效生产干扰素的体系。

1 干扰素简介干扰素是一种细胞因子。

它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构相似、功能相近的低分子糖蛋白。

干扰素干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统干扰素的种类很多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。

目前所知道的人体干扰素按细胞结构和来源分α、β、γ干扰素三个型别，α干扰素又称人白细胞干扰素，它是由B淋巴细胞和单核细胞产生的,它可以分为23种亚型，分别称为干扰素α1、α2a、α2b、α3等，它们相互之间有较高的同源性。

人β-干扰素又称人纤维母细胞产生的，有一个亚型。

γ一干扰素又称免疫干扰素，它是由淋巴细胞的辅助诱导细胞产生的，与α、β干扰素之间没有明显的同源性。

三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性。

基因工程干扰素是指从人细胞中克隆出干扰素基因，将此基因与大肠杆菌表达载体连接物构成重组表达质粒，然后转化到大肠杆菌中，从而获得高效表达人干扰素蛋白的工程菌, 工程菌经发酵后可收集到大量菌体，将菌体破裂，用先进的生物工程手段将干扰素蛋白从菌体分离、纯化，得到高纯度的人基因工程干扰素。

基因工程干扰素的出现，是干扰素研究工作的一项重大突破它使得干扰素能进人大规模产业化生产，人们能获得大量活性高、疗效好的干扰素。

2 干扰素的研究意义近年来，国际反病毒和抗癌研究领域，在自然免疫调节和抗病毒物质，作为一种天然抗病毒蛋白质干扰素人类开发更多的关注。

干扰素将成为一个21世纪的反病毒，防癌，其中最广泛使用的药物之一。

α-干扰素治疗慢性乙型肝炎是目前抗病毒药物的第一选择是，对肝炎的药物治疗总有效率约为20％-30％。

慢性肝炎的药物干扰素代表发展方向。

它是唯一的C型肝炎病毒的药物有效的治疗，它是最广泛的肿瘤细胞因子的临床治疗。

病毒性皮肤病，慢性宫颈炎，呼吸道病毒感染和妇科疾病，丘疹皮疹，造血系统恶性肿瘤，淋巴瘤，其主要标志。

β-干扰素治疗多发性硬化症复发静脉使用。

主要γ-干扰素治疗类风湿关节炎。

γ-干扰素的免疫功能比α，β-干扰素强1000倍，不仅能增强机体免疫功能，自身免疫性疾病，还可以调整过渡到接近正常水平的免疫力。

干扰素还用于生殖器衣原体感染，膀胱癌，生殖器疣，皮肤疾病，血液病，艾滋病相关综合征的治疗。

世界上许多国家已批准生产和使用基因重组干扰素制剂为许多疾病的治疗。

治疗后的临床应用表明，通常不严重的副作用，干扰素治疗，临床适应症正在不断发展扩大了干扰素的新用途。

3干扰素的适用症、禁忌症及副作用我们知道，人体的干扰素是在病毒感染后机体细胞产生的一种抗病毒的糖蛋白，是广谱抗病毒物质，能抑制多种DNA病毒的生长繁殖而不影响正常细胞的功能。

干扰素（IFN）的作用机制除了诱导一些抗病毒蛋白（例如2，5寡腺苷酸合成酶可以降解病毒mRNA，蛋白激酶K可以阻断病毒蛋白翻译）直接抗病毒外，还可以通过免疫调节（例如促进感染的肝细胞表达HLA-I类抗原、增加NK细胞活性）间接起到抗病毒作用。

普通干扰素α因其半衰期短，隔天给药应用不太方便。

聚乙二醇干扰素α（PEG IFN-α）是将惰性的聚乙二醇分子（无活性、无毒性）,一线性或者分枝状连接在干扰素分子上，而达到延缓其吸收和排泄，从而延长其半衰期，可以一周注射一次。

目前用于治疗乙型肝炎的干扰素主要为亚型。

有资料证实干扰素特别是长效干扰素对慢性乙肝的治疗，大约有10%的患者可能出现表面抗体（HBsAb)的阳转,这个结果是其它药物难以达到的。

3.1禁忌症妊娠、精神病史、未能控制的癫痫、未戒断酗酒/吸毒、未控制的自身免疫性疾病、失代偿肝硬化、有症状的心脏病、治疗前中性粒细胞绝对计数≤1.0×109/L、血小板<50×109/L。

相对禁忌症：甲状腺疾病、视网膜病、银屑病、既往抑郁史、未控制糖尿病、未控制高血压、总胆红素>50μmol/L特别是以间接胆红素为主者。

治疗前，干扰素疗效好坏可以采用预测因素：（以下因素越多疗效越好）1，治疗前的高ALT水平；2，HBVDNA<1.000E+008；3，女性；4，病情短；5，非母婴传播；6，肝脏纤维化程度轻；7，对治疗依从性好；8，无HCV、HDV、HIV合并者。

3.2副作用干扰素也有副作用，常见副作用及处理方法如下：1.流感样症候群：表现为发热、寒战、全身不适，肌痛、头痛等，有时还可出现鼻塞、流涕、头晕、尿急等，而以发热最为常见。

不论应用途径及剂量大小，患者均可有发热，一般在第一次注射后2-6小时发生，体温可升至38~40℃，6-12小时达到高峰，但24小时内均能自然消退。

若发热不高，可不必特殊处理，38℃者多喝开水，卧床休息，但若发热较高甚或高烧者，可以给予温水擦浴等物理降温，也可以睡前注射干扰素或者同时服用解热镇痛药。

2.一过性骨髓抑制：主要有外周血白细胞（中性粒细胞）及血小板数量减少；白细胞减少通常发生于使用后数小时至数日。

使用第一周，白细胞减少至40％-60％，而后趋于稳定。

停药或间歇5天以上使用，白细胞可迅速恢复。

主要是干扰素能可逆性地阻断白细胞从骨髓释放的缘故。

长期应用极少见的人可出现血色素性贫血，引起免疫介导的溶血性贫血和血小板减少。

通常可口服养血饮、复方阿胶浆等来纠正，亦可服利血生、鲨肝醇等药以升高白细胞及血小板。

如果中性粒细胞绝对计数≤1.0×109/L、血小板<50×109/L,应该减少剂量，一至二周后复查如血细胞恢复，药物剂量也可复原。

如中性粒细胞≤0.75×109 /L，血小板≤30×109 /L，应该停药。

3.精神异常：可以表现为压抑、妄想症、重度焦虑、等精神病症状。

因此应用干扰素之前要评估患者的精神状况，治疗过程也要密切加以观察。

抗压抑药物可以缓解此类不良反应，但对症状严重者，应该及时停药。

4.消化系统反应：如食欲不振、味觉异常、恶心、呕吐、泄泻、腹胀等。

药量越大，症状越频繁，但一般不需治疗，较重者可对症处理。

严重者应考虑减量或停药。

5.皮肤反应：使用超过4个月者部分人可有轻、中度脱发，一般停药后可有恢复，偶有停药后更严重者。

斑丘疹多发生于躯干和四肢，但多为暂时性的；还有发生潜在特异性反应，表现为弥漫性红斑及荨麻疹等。

轻度皮疹多呈自限性，不必处理；严重者应考虑停药或减量，并给抗过敏治疗。

6.肾脏损害：最常见者为轻度蛋白尿，少有＞0.1克／日，亦不伴有血浆蛋白的减少。

其他肾脏损害虽有报道但极少见。

通常无需特殊处理，嘱患者多喝开水即可。

7.对内分泌系统的影响：11-羟皮质类固醇增加，雌激素水平下降，高密度脂蛋白降低，出现糖尿，偶见高血钾、低血钙等症，还能提高血浆甘油三酯含量，但对胆固醇无影响。

女性患者17b雌二醇、黄体激素的减低和延迟，会使月经周期延长，停药后可恢复。

8.抗干扰素抗体的产生：部分患者治疗初期甚至未应用干扰素时即出现抗干扰素抗体，影响治疗效果。

估计与个体差异有关，而与应用剂量、给药途径、时间长短及患者年龄无明显关系。

有人换用不同的基因型制剂，减少干扰素抗体的产生，而提高干扰素疗效。

9.干扰素诱导产生自身抗体和自身免疫性疾病：包括甲状腺抗体、抗核抗体和抗胰岛素抗体。

多数情况下无明显临床症状，部分患者可出现甲状腺功能低下或者亢进、糖尿病、血小板减少、银屑病、白斑、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮样综合症等，严重者要停药。

此外，尚可对心血管、骨髓系统的影响和对生长的抑制等，都应该作出相应的对症处理，甚至停药。

4 干扰素的生产过程及优化生产4.1干扰素的生产过程及注意事项1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。

然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。

2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。

3.发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。

级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。

然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。

同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。

或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

4. 菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。

进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。

菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。

每保存3个月，检查一次活性。

5.干扰素发酵过程控制在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。

而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。

可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。

(1)．溶解氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。

通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。

(2). 温度控制假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。

产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。

质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。

(3)．pH值发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。