生物所-福建农业科学院
土壤微生物群落磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记多样性分析
土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFA）生物标记多样性分析1*土壤微生物群落磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记多样性分析(福建农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003)摘要: 磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记法是一种可定性和定量分析土壤中微生物群落多样性的方法。
本研究以烟田土壤为例，应用生态学评价方法，即丰富度指数(S)、Pielou均匀度(J),Simpson优势度指数(D)、Shannon-Wienner(H1),Brillouin(H2)和Mcintosh(H3)多样性指数等测度方法，分析土壤中微生物群落PLFA生物标记的多样性。
研究结果表明，供试土壤微生物群落中，先后出现了43种PLFAs。
将其聚类分析，可以将所获得的PLFA分成五大类:第?类为高含量、高频次和多样性，PLFA为18:1ω9c的真菌生物标记;第?类为高含量、高频次和多样性，PLFA为16:0的假单胞菌标记;第?类为高含、高频次，多样性中等，PLFA为16:1ω5c的甲烷氧化菌生物标记;第?类为中等含量，频次较高，多样性中等，含有表量征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的PLFA，还有表征厌氧菌的18:1ω7c以及硫酸盐还原菌的16:0 10Me;第?类为低含量，低频次和多样性，其特征生物标记有表征好氧菌的i 15:0 3OH、15:1 i G、a16:0、i16:1 G、i16:1 H、17:0、i17:0、15:0 2OH、15:0 3OH、17:0和17:0 2OH的PLFA，存在有表征真菌的18:3ω6c (6,9,12)、放线菌的17:0 10Me和18:0 10Me以及表征原生动物的20:4ω6,9,12,15c。
说明供试土壤中能够起主导作用的功能菌依次是真菌、假单胞菌、甲烷氧化菌和部分的好氧菌、厌氧菌及硫酸盐还原菌，将为合理调节土壤微生态系统提供指导。
是一种可行的评价土壤微生物群落多样性的新方法。
一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３２８￣３３５ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ邓㊀云ꎬ苏㊀妍ꎬ姚锦爱ꎬ等.一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３２８￣３３５.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００４一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果邓㊀云１ꎬ㊀苏㊀妍１ꎬ㊀姚锦爱２ꎬ㊀田大刚３ꎬ㊀阮宏椿２ꎬ㊀肖㊀翔１ꎬ㊀刘㊀友１(１.福建省南平市农业科学研究所ꎬ福建南平３５４２００ꎻ２福建省农业科学院植物保护研究所ꎬ福建福州３５００１３ꎻ３.福建省农业科学院生物技术研究所ꎬ福建福州３５０００１)收稿日期:２０２２￣０４￣０７基金项目:福建省人民政府￣中国农业科学院农业高质量发展超越５５１１ 协同创新工程项目(ＸＴＣＸＧＣ２０２１０１７㊁ＸＴＣＸＧＣ２￣０２１０１１)ꎻ福建省农业科学院科技创新团队建设项目(ＳＴＴＴ２０２１￣２￣２)作者简介:邓㊀云(１９８１－)ꎬ女ꎬ江西临川人ꎬ硕士ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物保护研究ꎮ(Ｔｅｌ)158****7971ꎻ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２５３６２６６３＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:阮宏椿ꎬ(Tel)138****3259ꎻ(E￣mail)hcruan＠１２６.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀为丰富小麦赤霉病病菌拮抗菌资源ꎬ寻找替代化学杀菌剂的生物防治方法ꎬ采用平板稀释涂布法从小麦赤霉病抗性鉴定圃土壤㊁小麦根部和周边植物根部分离拮抗细菌ꎬ明确其分类地位ꎬ并采用灌根和穗部喷施法测定其对小麦赤霉病防治效果ꎮ结果表明ꎬ本研究共分离获得１８株拮抗细菌ꎬ筛选出杀菌谱广㊁对小麦赤霉病病菌抑菌效果较好的拮抗菌Ｄ０９ꎻ其对小麦赤霉病禾谷镰刀菌抑制率达到６７ ９２％ꎮ根据形态特征㊁生理生化特性和分子鉴定ꎬ初步鉴定拮抗菌Ｄ０９为木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)ꎮ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液灌根处理对小麦赤霉病的田间防治效果达到５０ ９３％ꎬ与常用杀菌剂氟硅唑穗部喷雾处理无显著性差异ꎮＤ０９发酵液灌根处理的小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(ＤＯＮ)毒素含量低于苯甲嘧菌酯穗部喷雾处理ꎬ与氟硅唑穗部喷雾处理无显著性差异ꎬ玉米赤霉烯酮(ＺＥＮ)㊁雪腐镰刀菌烯醇(ＮＩＶ)２种毒素含量与戊唑多菌灵㊁苯甲嘧菌酯㊁氟硅唑穗部喷雾处理无显著性差异ꎮ综上ꎬ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对多种植物病原真菌具有广谱抗性ꎬ对小麦赤霉病有较好的防治效果ꎬ对ＤＯＮ㊁ＺＥＮ㊁ＮＩＶ３种毒素具有抑制作用ꎬ作为小麦赤霉病的生防材料ꎬ具有良好的开发应用前景ꎮ关键词:㊀无色杆菌ꎻ拮抗菌ꎻ小麦赤霉病中图分类号:㊀Ｓ４７６㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３２８￣０８ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｔｒａｉｎａｎｄｉｔｓｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｏｎＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔＤＥＮＧＹｕｎ１ꎬ㊀ＳＵＹａｎ１ꎬ㊀ＹＡＯＪｉｎ￣ａｉ２ꎬ㊀ＴＩＡＮＤａ￣ｇａｎｇ３ꎬ㊀ＲＵＡＮＨｏｎｇ￣ｃｈｕｎ２ꎬ㊀ＸＩＡＯＸｉａｎｇ１ꎬ㊀ＬＩＵＹｏｕ１(１.ＮａｎｐｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｐｉｎｇ３５４２００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＦｕｚｈｏｕ３５００１３ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＦｕｚｈｏｕ３５０００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｎｒｉｃｈｔｈｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａａｇａｉｎｓｔＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔａｎｄｆｉｎｄａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎ￣ｔｒｏｌｍｅｔｈｏｄｔｏｒｅｐｌａｃｅｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓꎬａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌｏｆｗｈｅａｔｓｃａｂｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｎｕｒｓｅｒｙꎬｗｈｅａｔｒｏｏｔｓａｎｄｔｈｅｒｏｏｔｓｏｆｔｈｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｐｌａｎｔｓｂｙｐｌａｔｅｄｉｌｕｔｉｏｎｃｏａｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄｔｈｅｉｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｗａｓｃｌａｒｉｆｉｅｄ.ＴｈｅｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔａｇａｉｎｓｔＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｒｏｏｔｉｒｒｉｇａｔｉｏｎａｎｄｅａｒｓｐｒａｙｉｎｇ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｔｏｔａｌｏｆ１８ｓｔｒａｉｎｓｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｄｔｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＤ０９ｗｉｔｈｂｒｏａｄｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄｇｏｏｄａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｗｈｅａｔｓｃａｂｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔ.ＩｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅａｇａｉｎｓｔＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍｒｅａｃｈｅｄ６７ ９２％.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ￣ｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎬｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ￣ｔｉｃｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅＤ０９ｗａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉ￣ｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ.ＴｈｅｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｏｆＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｎＦｕｓａｒｉ￣８２３ｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔｒｅａｃｈｅｄ５０ ９３％ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅ.Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＤＯＮ)ｔｏｘｉｎｉｎｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｗｈｅａｔｇｒａｉｎｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＤ０９ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｔｒｅａ￣ｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎꎬａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ.Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ(ＺＥＮ)ａｎｄｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＮＩＶ)ｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｆｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ ｃａｒｂｅｎｄａ￣ｚｉｍꎬｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎꎬａｎｄｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅ.ＩｎｓｕｍｍａｒｙꎬＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９ｈａｓｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉꎬｈａｓｇｏｏｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｏｎＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔꎬａｎｄｈａｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｎＤＯＮꎬＺＥＮａｎｄＮＩＶｔｏｘｉｎｓ.ＡｓａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔꎬＤ０９ｈａｓｇｏｏｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒꎻａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａꎻＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ㊀㊀赤霉病(ＦＨＢ)是世界性病害ꎬ主要是由禾谷镰刀菌引起的一种严重影响禾谷类作物产量和品质的毁灭性病害[１]ꎮ小麦赤霉病广泛分布于中国温暖潮湿或半潮湿地区ꎬ多发于长江中下游冬麦区㊁川滇冬麦区及华南冬麦区ꎬ对小麦生产的危害甚大[２]ꎮ１９９３－２００１年ꎬ赤霉病给美国小麦和大麦生产造成的直接经济损失高达７.６７ˑ１０９美元[３]ꎮ赤霉病在带来产量损失的同时ꎬ引发小麦赤霉病的镰刀菌所产生的ＤＯＮ(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)㊁ＮＩＶ(雪腐镰刀菌烯醇)㊁ＺＥＮ(玉米赤霉烯酮)等真菌毒素在粮食中存在ꎬ会使得人类或动物食用后出现呕吐㊁怀孕母畜中毒后流产等症状[２]ꎮＤＯＮ㊁ＮＩＶ等毒素能影响真核细胞中蛋白质㊁ＤＮＡ㊁ＲＮＡ的合成以及线粒体功能㊁细胞分裂㊁膜功能等ꎬ从而对人和动物的健康与免疫产生抑制作用[４]ꎮ１９９８年ꎬ国际癌症机构公布的评估报告中ꎬＤＯＮ被列为第３类致癌物ꎬ与人类食管癌㊁ＩｇＡ肾病㊁胃癌和骨关节病有关[４]ꎮ小麦赤霉病的流行主要是由于稻桩或土壤中的腐殖质残留携带镰刀菌ꎬ在合适的气候环境下爆发引起的ꎮ土壤中如富含抑制禾谷镰刀菌的微生物ꎬ将有利于控制赤霉病的流行[５￣９]ꎮ使用化学杀菌剂是目前麦类生产中控制赤霉病的主要方法[１０]ꎬ但是长期使用化学农药一方面容易导致禾谷镰刀菌产生抗药性ꎬ另一方面还会带来农药残留㊁环境污染等问题ꎮ因此ꎬ筛选出具有抑制赤霉病病菌等多种病原真菌的广谱拮抗菌ꎬ研制微生物农药对促进和提升小麦生产具有现实意义ꎮ微生物农药具有易降解㊁无污染㊁无残留的特点ꎬ符合国家绿色生产的需求ꎬ已经在绿色农产品和有机农产品生产中得到应用[１１￣１３]ꎮ目前ꎬ微生物农药研究比较多的菌种为解淀粉芽孢杆菌㊁枯草芽孢杆菌㊁多黏类芽孢杆菌[１４￣１７]等ꎮ近年来ꎬ无色杆菌引起了众多研究人员的重视ꎮ无色杆菌一方面可以产生广谱抗生素ꎬ对欧文氏菌㊁白色念球菌㊁肺炎克雷伯菌等具有较强的抑菌活性[１８￣１９]ꎬ另一方面也可以分泌杀虫蛋白ꎬ对害虫生物防治同样具有良好的应用价值[２０]ꎮ此外ꎬ无色杆菌在环境保护中也有很好的应用价值ꎬ常用于土壤或废水中㊁农药残留㊁染料等有害物质的降解[２１￣２２]ꎮ本研究从福建省南平市农业科学研究所小麦赤霉病自然抗性鉴定圃中土壤㊁小麦植株根部及鉴定圃周边植物的根系中分离出具有广谱抑制真菌活性的菌株ꎬ根据形态特征观察㊁生理生化反应和系统发育树分析ꎬ鉴定其种属及分类地位ꎮ进一步通过田间试验测定其对小麦赤霉病的防治效果和对ＤＯＮ㊁ＺＥＮ㊁ＮＩＶ等毒素生成的抑制作用ꎬ为该菌株的开发应用提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀拮抗菌菌株和真菌菌株㊀拮抗菌菌株分离自福建省南平市农业科学研究所小麦赤霉病自然抗性鉴定圃表层下５~２０ｃｍ深度的土样㊁鉴定圃中供试小麦品种的根部及鉴定圃周围的植物根部ꎮ供试的１２株病原真菌菌株编号和具体来源见表１ꎮ１.１.２㊀供试的化学药剂㊀６０ ０％戊唑多菌灵水分散粒剂和３２ ５％苯甲嘧菌酯悬浮剂由河北冠龙农化有限公司生产ꎬ４０ ０％氟硅唑乳油由陕西标正作物科学有限公司生产ꎮ１.１.３㊀供试小麦品种㊀高感赤霉病的冬小麦扬辐麦４号ꎬ由江苏里下河地区农业科学研究所提供ꎮ１.１.４㊀培养基配制㊀ＮＡ(细菌)培养基:蛋白胨１０ｇ㊁牛肉膏３ｇ㊁ＮａＣｌ５ｇ㊁琼脂１５ｇꎬ定容至１０００ｍｌꎬｐＨ值７ ３ꎮＮＢ(细菌)培养液:蛋白胨１０ｇ㊁牛肉膏３ｇ㊁ＮａＣｌ５ｇ㊁定容至１０００ｍｌ㊁ｐＨ值７ ３ꎮＰＤＡ培养基(真菌或细菌):马铃薯２５０ｇ㊁葡萄糖２０ｇ㊁琼脂２０ｇ㊁定容至１０００ｍｌꎮ红糖豆粉发酵液:红糖２３ ３ｇ㊁ＣａＣＯ３４ ９ｇ㊁豆粉１１ １ｇ㊁ＫＮＯ３８ ０ｇ㊁ＫＨ２ＰＯ４０ ５ｇ㊁Ｋ２ＨＰＯ４１ ２ｇ㊁ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ５ ０ｇ㊁ＮａＣｌ３ ０ｇ㊁定容至１０００ｍｌꎮ９２３邓㊀云等:一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果１.１.５㊀微生物菌液助剂配方㊀添加剂配方为湿润剂Ｄ４２５(烷基磺酸缩聚物)４ ８％ꎬ分散剂ＰＶＡ(聚乙烯醇)７ ２％ꎬ保护剂ＦＷＡ(荧光增白剂)０ １％ꎬ稳定剂ＣＭＣ￣Ｎａ(羧甲基纤维素钠)２ ０％[２３]ꎮ表１㊀供试的病原菌菌株及来源Ｔａｂｌｅ１㊀Ｔｅｓｔｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｓｏｕｒｃｅｓ编号病原菌㊀㊀㊀㊀来源㊀㊀㊀㊀１香蕉枯萎病尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｃｕｂｅｎｓｅ)福建农林大学植物保护学院２水稻纹枯病立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ)中国农业科学院植物保护研究所３玉米叶斑病平脐蠕孢(Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ)福建农林大学植物保护学院４芦笋颈枯病菌(Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓａｓｐａｒａｇｉ)福建省农业科学院植物保护研究所５黄瓜枯萎病菌[Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ(Ｓｃｈｌ.)Ｆ.ｓｐｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍＯｗｅｎ]福建农林大学植物保护学院６丝瓜枯萎镰刀菌[Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ(Ｓｃｈｌ.)Ｆ.]四川省农业科学院植物保护研究所７香蕉褐缘灰斑病菌(Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｍｕｓｉｃｏｌａ)福建省农业科学院植物保护研究所８大豆根腐尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)福建省农业科学院植物保护研究所９大豆炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｉ)福建省农业科学院植物保护研究所１０白菜菌核核盘菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)四川省农业科学院植物保护研究所１１小麦赤霉病禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)福建省南平市农业科学研究所１２小麦赤霉病亚洲镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ)福建省南平市农业科学研究所１.２㊀方法１.２.１㊀拮抗菌菌株的分离和纯化㊀土壤样品中的菌株采用稀释涂布平板法分离[２４]ꎬ植物根部内生菌采用表面消毒法进行分离[２５]ꎮ得到的拮抗菌菌株进行编号ꎬ２次单菌落划线纯化ꎬ纯化后的菌株采用甘油法保藏于－８０ħ冰箱ꎮ１.２.２㊀拮抗菌菌株的筛选及拮抗谱的测定㊀分离的菌株采用划线平板对峙法进行拮抗菌菌株筛选ꎮ选择表１中的１２个真菌作为靶标病原真菌ꎮ先挑取纯化后的细菌菌落在对应的ＰＤＡ或ＮＡ培养基上活化ꎬ挑取靶标病原真菌新鲜菌块接种到ＰＤＡ或ＮＡ培养基(直径６ｃｍ培养皿)的中央ꎬ再以靶标病原真菌菌株的菌丝块为中心ꎬ对拮抗细菌菌落画边长为４ｃｍ的正方形方框[２６]ꎬ以只接种靶标病原真菌作为对照ꎻ于２８ħ下培养５~７ｄꎬ观察生长情况ꎬ筛选出的拮抗效果好的菌株进行抑菌谱测定ꎬ测量抑菌带宽度和菌落直径ꎬ计算抑菌效果ꎮ１.２.３㊀拮抗菌的鉴定㊀菌落形态特征观察:纯化后的菌株用ＮＢ培养液培养２４ｈꎬ取１００μｌ菌液用无菌水稀释１０００倍ꎬ取１００μｌ均匀涂布于ＰＤＡ平板上ꎬ２８ħ恒温培养４８ｈꎬ观察单菌落的形态特征[２７]ꎮ菌体形态采用革兰氏染色法染色后ꎬ在１０００倍显微镜下用带刻度尺的载玻片进行观察ꎮ１６ＳｒＤＮＡ序列同源性鉴定:结合菌落特征和菌体形态对菌株进行初步分类ꎬ对菌株进行１６ＳｒＤＮＡ序列测定ꎬＤＮＡ提取由生工生物工程(上海)股份有限公司完成ꎮＰＣＲ所用的引物融合了Ｍｉｓｅｑ测序平台的Ｖ３￣Ｖ４通用引物８０５Ｒ(上游引物５ᶄ￣ＧＡＣＴＧ￣ＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ￣３ᶄꎬ下游引物５ᶄ￣ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ￣３ᶄ)和３４１Ｆ(上游引物５ᶄ￣ＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧ￣３ᶄꎬ下游引物５ᶄ￣ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ￣３ᶄ)ꎮＰＣＲ反应体系:２ˑＴａｑｍａｓｔｅｒＭｉｘ１５μｌꎬＢａｒ￣ＰＣＲｐｒｉｍｅｒＦ(１０μｍｏｌ/Ｌ)１μｌꎬＰｒｉｍｅｒＲ(１０μｍｏｌ/Ｌ)１μｌꎬＧｅ￣ｎｏｍｉｃＤＮＡ２０ｎｇꎬ加Ｈ２Ｏ至３０μｌꎮＰＣＲ扩增程序:９４ħ预变性５ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５５ħ退火２０ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ２５次循环ꎻ最后７２ħ延伸５ｍｉｎꎮＤＮＡ序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成ꎮ１６ＳｒＤＮＡ序列在核糖体数据库(ｈｔｔｐ://ｒｄｐ.ｃｍｅ.ｍｓｕ.ｅｄｕ/ｉｎｄｅｘ.ｊｓｐ)中进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ利用ＭＥＧＡ７软件构建系统发育进化树ꎮ生理生化测试:对具有生防潜力的菌株进一步开展Ｄ￣葡萄糖㊁Ｄ￣木糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁纤维素利用及耐盐性㊁水解淀粉㊁甲基红试验㊁Ｖ￣Ｐ反应㊁Ｈ２Ｓ产生㊁纤维素利用㊁４２ħ生长㊁厌氧生长等生理生化指标测试ꎮ０３３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期１.２.４㊀拮抗菌对小麦赤霉病田间防效及小麦籽粒毒素测定㊀拮抗菌对小麦赤霉病田间防效试验于２０２０－２０２１年度在福建省南平市农业科学研究所试验基地进行ꎮ该基地有全国冬小麦国家区试赤霉病自然抗性鉴定圃ꎬ赤霉病常年自然发生ꎬ无需接种赤霉病菌ꎮ冬小麦品种扬辐麦４号于１１月１６日播种ꎬ次年２月１１日始穗ꎬ２月１４日始花ꎮ试验设拮抗菌发酵液(按微生物菌液助剂配方配置)灌根㊁拮抗菌发酵液穗部喷雾㊁６０％戊唑多菌灵水分散粒剂穗部喷雾㊁３２ ５％苯甲嘧菌酯穗部喷雾㊁４０％氟硅唑穗部喷雾５个处理及清水穗部喷雾对照ꎮ施药前用平板血球计数法检测菌液的有效菌含量ꎬ穗部喷施发酵液有效成分含量为１.５ˑ１０１３ＣＦＵ/ｈｍ２ꎬ土壤灌根浇施有效成分含量３.０ˑ１０１３ＣＦＵ/ｈｍ２ꎮ灌根处理在小麦始穗期灌根１次ꎬ喷雾处理分别在始穗期㊁始花期和盛花期各喷施１次ꎬ每个小区２０ｍ２ꎬ３次重复ꎮ４月１５日小麦成熟后调查赤霉病发病情况ꎬ各处理选取病麦粒１ｋｇꎬ３次重复ꎬ委托中国农业科学院果树研究所对小麦籽粒的ＤＯＮ㊁ＺＥＮ㊁ＮＩＶ毒素含量进行检测ꎮ各处理防效的计算按下式进行:防效＝(清水对照下的病小穗率－处理下病小穗率)/清水对照下的病小穗率ˑ１００％１.２.５㊀数据处理和分析㊀采用ＩＢＭＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ１９软件选择单因素方差分析㊁方差同质性检测和Ｗａｌｌｅｒ￣Ｄｕｎｃａｎ的选项进行数据处理分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀拮抗细菌的筛选本试验共分离出１８株拮抗菌菌株ꎬ１６ＳｒＤＮＡ序列测定均为细菌ꎬ１８株拮抗菌菌株对１２种病原真菌的抗菌谱结果见表２ꎮ其中ꎬ枯草芽孢杆菌(Ｄ０１)㊁多黏类芽孢杆菌(Ｄ０４㊁Ｄ１７)㊁木糖氧化无色杆菌(Ｄ０９㊁Ｄ１１)㊁越南伯克霍尔德氏菌属(Ｄ１２)㊁洋葱伯克霍尔德氏菌属(Ｄ１４)等７株菌株对小麦赤霉病等病原真菌表现出广谱拮抗效果ꎬ而菌株Ｄ０９木糖氧化无色杆菌的抑制作用明显高于其他６株菌菌株ꎮ此外ꎬ表２中有３株木糖氧化无色杆菌Ｄ０８㊁Ｄ０９和Ｄ１１ꎬ但３者却表现出不同的抑菌效果ꎮ表２㊀１８株拮抗菌的抑菌效果Ｔａｂｌｅ２㊀Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆ１８ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ序号菌属病原菌１２３４５６７８９１０１１１２Ｄ０１枯草芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ０２巨大芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)－－－－－－－－－－－＋Ｄ０３嗜麦芽糖寡养单胞菌属(Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ)－－－－－－－－－－－－Ｄ０４多黏类芽孢杆菌(Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ０５贝莱斯芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ)－－－－－－－－－－－－Ｄ０６栖稻假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ)－－－－－－－－－－－＋＋Ｄ０７苏云金芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ)－－－－－－－－－－－－Ｄ０８木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)－－－－＋－－－－－－－Ｄ０９木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ１０阿氏肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ)－－－－－－－－－－－－Ｄ１１木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ１２越南伯克霍尔德氏菌属(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ１３库德里阿兹威毕赤酵母(Ｐｉｃｈｉａｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ)－－－－－－－－－－－－Ｄ１４洋葱伯克霍尔德氏菌属(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ１５黏质沙雷氏菌属(Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ)－－＋－－－－－－－－－Ｄ１６蕈状芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｙｃｏｉｄｅｓ)－－－－＋－－－－－－＋Ｄ１７多黏类芽孢杆菌(Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ)＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｄ１８黏质沙雷氏菌属(Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ)＋－－－－－－－－－－＋病原菌１~１２见表１ꎻ＋表示有拮抗作用ꎬ＋＋表示强拮抗作用ꎬ－表示弱拮抗作用ꎮ１３３邓㊀云等:一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果２.２㊀拮抗菌Ｄ０９的鉴定２.２.１㊀拮抗菌Ｄ０９的形态学观察㊀筛选出的广谱抗病原真菌的木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙ￣ｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)Ｄ０９为赤霉病鉴定圃周边生长多年的吊兰根系中分离ꎬ中国典型培养物保藏中心保藏号为Ｍ２０２１１００２ꎮ菌株在ＰＤＡ固体培养基上生长时ꎬ表面湿润㊁淡黄色㊁光滑㊁透明㊁微隆起㊁边缘较整齐㊁胶状㊁黏性强ꎻ革兰氏染色阴性ꎬ１０００倍显微镜下观察菌体短杆状(图１)ꎬ长度为２.０~４ ０μｍꎬ宽度为０.５~０ ９μｍꎮ图１㊀Ｄ０９菌群落(左)及菌体(右)形态(ˑ１０００)Ｆｉｇ.１㊀Ｄ０９ｃｏｌｏｎｙ(ｌｅｆｔ)ａｎｄｍｙｃｅｌｉａ(ｒｉｇｈｔ)ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ(ˑ１０００)２.２.２㊀拮抗菌Ｄ０９的的生理生化特性㊀拮抗菌Ｄ０９能利用Ｄ￣葡萄糖㊁Ｄ￣木糖㊁乳糖㊁蔗糖等多种碳源ꎬ产酸ꎬ能利用纤维素ꎬ明胶液化速度快ꎬ其他生理生化特征见表３ꎮ表３㊀菌株Ｄ０９的生理生化特性Ｔａｂｌｅ３㊀ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｔｒａｉｎＤ０９测试项目㊀㊀㊀㊀㊀生理生化特性耐盐性(５％)耐盐Ｄ￣葡萄糖利用Ｄ￣木糖利用乳糖利用蔗糖利用水解淀粉水解甲基红试验阴性Ｖ￣Ｐ反应阴性Ｈ２Ｓ产生不产生明胶液化液化柠檬酸钠不能利用纤维素利用４２ħ生长生长厌氧生长生长２.２.３㊀拮抗菌Ｄ０９的分子鉴定㊀拮抗菌Ｄ０９的系统进化树见图２ꎮ１６ＳｒＤＮＡ的碱基序列长度为１４６９ｂｐꎬ在ＧｅｎＢａｎｋ的登录号为ＣＰ０１２０４６.１ꎮ根据ＢＬＡＳＴ比对结果ꎬ并结合形态特征和生理生化特性ꎬ鉴定该菌株为木糖氧化无色杆菌(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ)ꎮＮＰＤＹ２０Ｚ:Ｄ０９ꎮ图２㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９的系统进化树Ｆｉｇ.２㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９２.３㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９的抑菌谱木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对１２种病原真菌的抑菌效果如图３所示ꎮＤ０９菌株对所有测试的病原真菌均有不同程度的拮抗作用ꎬ表现出广谱抗病原真菌的特性ꎮ其中ꎬ对水稻纹枯病立枯丝核菌㊁芦笋颈枯病菌㊁香蕉褐缘灰斑病菌和大豆炭疽病菌的抑制率均达到７０％以上(表４)ꎮ病原菌１~１２见表１ꎮ图３㊀Ｄ０９菌株对多种病原真菌的拮抗效果Ｆｉｇ.３㊀ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｔｒａｉｎＤ０９ｏｎｖａｒｉｏｕｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ２３３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期表４㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９的抑菌谱Ｔａｂｌｅ４㊀ＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９编号病原菌抑制率(％)１香蕉枯萎病尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｃｕｂｅｎｓｅ)５７.９２ｆ２水稻纹枯病立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ)７４.１２ｂｃ３玉米叶斑病平脐蠕孢菌(Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ)５６.１７ｆ４芦笋颈枯病菌(Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓａｓｐａｒａｇｉ)７５.５６ｂ５黄瓜枯萎病菌[Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ(Ｓｃｈｌ.)Ｆ.ｓｐｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍＯｗｅｎ]６２.５５ｅ６丝瓜枯萎镰刀菌[Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ(Ｓｃｈｌ.)Ｆ.]６２.９４ｅ７香蕉褐缘灰斑病菌(Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｍｕｓｉｃｏｌａ)７８.５４ａ８大豆根腐尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)６３.５４ｅ９大豆炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｉ)７２.９１ｃ１０白菜菌核核盘菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)６９.２２ｄ１１小麦赤霉病禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)６７.９２ｄ１２小麦赤霉病亚洲镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ)５６.１６ｆ数据后不同小写字母表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ２.４㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对小麦赤霉病的田间防治效果㊀㊀不同处理对小麦赤霉病的田间防治效果如表５ꎮ除戊唑多菌灵和苯甲嘧菌酯处理下的赤霉病病穗率比喷清水对照有显著降低ꎬ其他处理病穗率均在９５ ００％以上ꎬ与对照无显著差异ꎮ而各处理下病小穗率均显著低于喷清水对照ꎻ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液灌根处理和穗部喷雾处理后ꎬ病小穗率分别为１４ ４２％和２１ ４２％ꎬ比ＣＫ下降５０ ９３％和２７ １２％ꎻ其中Ｄ０９发酵液灌根处理病小穗率与苯甲嘧菌酯和氟硅唑穗部喷雾处理相当ꎮ化学药剂的防效大多在６０％以上ꎬ而木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液灌根处理和穗部喷雾处理的防效分别为５０ ９３％和２７ １２％ꎮ表５㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对小麦赤霉病的田间防治效果Ｔａｂｌｅ５㊀ＦｉｅｌｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９ｏｎｗｈｅａｔｓｃａｂ处理㊀㊀㊀病穗率(％)病小穗率(％)防治效果(％)Ｄ０９发酵液灌根９７.５０ʃ２.５０ｃ１４.４２ʃ０.６３ｂ５０.９３Ｄ０９发酵液穗部喷雾９５.００ʃ２.５０ｃ２１.４２ʃ４.８２ｃ２７.１２戊唑多菌灵穗部喷雾５７.５０ʃ５.００ａ４.８６ʃ０.８４ａ８３.４６苯甲嘧菌酯穗部喷雾８０.００ʃ５.００ｂ６.５３ʃ１.４６ａｂ７７.７８氟硅唑穗部喷雾９７.５０ʃ２.５０ｃ１１.８１ʃ３.８０ｂ５９.８２清水穗部喷雾(ＣＫ)１００.００ʃ０ｃ２９.３９ʃ７.７４ｄ同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ２.５㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对小麦籽粒毒素含量的影响㊀㊀不同处理下小麦籽粒ＤＯＮ㊁ＺＥＮ㊁ＮＩＶ３种毒素含量检测结果如表６所示ꎮ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液灌根处理小麦籽粒３种毒素的含量分别为０ ６２８ｍｇ/ｋｇ㊁０ ０１６ｍｇ/ｋｇ㊁１ ３０８ｍｇ/ｋｇꎬ穗部喷施Ｄ０９发酵液处理小麦籽粒３种毒素的含量分别为０ ８３６ｍｇ/ｋｇ㊁０ ０８０ｍｇ/ｋｇ㊁２ ６８８ｍｇ/ｋｇꎬ均显著低于喷清水对照ꎻＤ０９发酵液灌根处理小麦籽粒３种毒素的含量均低于穗部喷施Ｄ０９发酵液处理ꎻＤ０９发酵液灌根处理小麦籽粒ＤＯＮ毒素含量低于苯甲嘧菌酯穗部喷雾处理ꎬ与氟硅唑穗部喷雾处理相当ꎻＤ０９发酵液灌根处理小麦籽粒ＺＥＮ㊁ＮＩＶ毒素含量与戊唑多菌灵穗部喷雾㊁苯甲嘧菌酯穗部喷雾㊁氟硅唑穗部喷雾处理相当ꎮ表６㊀木糖氧化无色杆菌Ｄ０９对小麦籽粒毒素含量的影响Ｔａｂｌｅ６㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＤ０９ｏｎｔｏｘｉｎｃｏｎ￣ｔｅｎｔｉｎｗｈｅａｔｇｒａｉｎｓ处理㊀㊀㊀ＤＯＮ(ｍｇ/ｋｇ)ＺＥＮ(ｍｇ/ｋｇ)ＮＩＶ(ｍｇ/ｋｇ)Ｄ０９发酵液灌根０.６２８ʃ０.０３８ｂ０.０１６ʃ０.００２ａ１.３０８ʃ０.０８３ａｂＤ０９发酵液穗部喷雾０.８３６ʃ０.０１７ｃ０.０８０ʃ０.０１９ａ２.６８８ʃ０.９３８ｂ戊唑多菌灵穗部喷雾０.２３０ʃ０.０１７ａ０.０２８ʃ０.００５ａ０.７０８ʃ０.１９４ａ苯甲嘧菌酯穗部喷雾１.２０２ʃ０.０８０ｄ０.０８６ʃ０.０２２ａ１.６３ʃ０.１０１ａｂ氟硅唑穗部喷雾０.５２８ʃ０.０２８ｂ０.０２６ʃ０.００９ａ１.２９４ʃ０.０３４ａ清水穗部喷雾(ＣＫ)１.４２０ʃ０.１２２ｄ０.６６０ʃ０.０８５ｂ４.５８０ʃ１.００７ｃＤＯＮ:脱氧雪腐镰刀菌烯醇ꎻＺＥＮ:玉米赤霉烯酮ꎻＮＩＶ:雪腐镰刀菌烯醇ꎮ同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ３㊀讨论３.１㊀无色杆菌属抑菌功能属性的发现目前ꎬ国内外对无色杆菌研究主要在于其抑菌活性及降解农药残留㊁染料等功能方面[２８￣３６]ꎬ本研究在筛选鉴定木糖氧化无色杆菌菌株Ｄ０９的基础上ꎬ进一步分析了菌株Ｄ０９对小麦赤霉病的田间防治效果及小麦籽粒毒素含量的影响ꎬ为无色杆菌的农业应用进行了初步尝试ꎮ木糖氧化无色杆菌菌株Ｄ０９已申请国家发明专利(申请号:２０２１１１０４２１２４２)ꎮ３.２㊀微生物农药防治效果低于化学农药的探讨本研究结果表明ꎬ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液灌根处理ꎬ虽然病穗率与清水对照差异不大ꎬ但病小穗率和防效与常用化学药剂苯甲嘧菌酯穗部喷３３３邓㊀云等:一株木糖氧化无色杆菌的分离鉴定及其对小麦赤霉病的防治效果雾㊁氟硅唑穗部喷雾等处理相当ꎬ而Ｄ０９发酵液穗部喷雾处理虽然防治效果只有２７.１２％ꎬ但病小穗率亦显著低于清水对照ꎬ说明木糖氧化无色杆菌Ｄ０９能有效抑制赤霉病病菌在穗部的扩散ꎮ总体来说ꎬ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９发酵液处理的防效不及化学杀菌剂ꎬ这与拮抗菌的作用机制及其对环境的敏感性有关ꎮ研究中Ｄ０９灌根处理和穗部喷雾处理之间在病小穗率和防效上亦有一定差异ꎬ这说明不同施用方式对拮抗菌在田间的定殖有较大影响ꎮ木糖氧化无色杆菌Ｄ０９在田间定殖情况及其与化学杀菌剂复配使用方法还需要进一步研究ꎮ３.３㊀菌株Ｄ０９对小麦籽粒毒素含量的探讨本研究结果显示微生物农药或化学药剂对毒素的抑制效果和对赤霉病的防治效果不完全同步ꎮ如苯甲嘧菌酯穗部喷雾处理对赤霉病的控制效果高于Ｄ０９发酵液灌根ꎬ防效达７７.７８％ꎬ但小麦籽粒３种毒素含量却高于Ｄ０９发酵液灌根处理ꎮＭａｇａｎ等研究结果表明ꎬ嘧菌酯降低了小麦赤霉病的发病率ꎬ但其处理过的小麦籽粒ＤＯＮ毒素含量较高ꎬ可能与嘧菌酯使用导致毒素累积有关[３７]ꎻ本研究中嘧菌酯处理后ＤＯＮ等毒素含量虽比对照有所减少ꎬ但和其他药剂相比ꎬ嘧菌酯对毒素的产生和累积的抑制效果较低ꎮＤ０９发酵液处理对小麦籽粒ＤＯＮ㊁ＺＥＮ㊁ＮＩＶ３种毒素含量的控制机理还需进一步研究ꎮ致谢:㊀衷心感谢葛桂梅㊁黄继平㊁洪红升等同事对该试验给予的无私帮助!参考文献:[１]㊀ＢＡＩＧＨ.ＳＨＡＮＥＲＧ.ＭａｎａｇｅｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｗｈｅａｔａｎｄｂａｒｌｅｙｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｔｏｐａ￣ｔｈｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ４２(１):１３５￣１６１.[２]㊀邓㊀云.一株拮抗性多黏类芽孢杆菌的鉴定及其不同施用方法对小麦赤霉病的防效[Ｊ].福建农林大学学报(自然科学版)ꎬ２０２２ꎬ５１(１):２１￣２６.[３]㊀ＢＡＩＧＨꎬＳＵＺＱꎬＣＡＩＪ.ＷｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ[Ｊ].ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ４０(３):３３６￣３４６.[４]㊀ＲＯＣＨＡＯꎬＡＮＳＡＲＩＫꎬＤＯＯＨＡＮＦＭ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｒｉｃｈｏｔｈｅｓｅｎｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｏｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＦｏｏｄＡｄｄｉｔＣｏｎｔａｍꎬ２００５ꎬ２２:３６９￣３７８.[５]㊀ＥＲＩＫＳＥＮＧＳꎬＡＬＥＸＡＮＤＥＲＪ.Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｘｉｎｓｉｎｃｅｒｅａｌｓ￣ａｒｉｓｋａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ[Ｊ].ＴｅｍａＮｏｒｄꎬ１９９８ꎬ５０２:７￣４４.[６]㊀周雪婷.粮食中ＤＯＮ的危害分析及快速测定方法研究进展[Ｊ].分析检测ꎬ２０１９ꎬ１０(５１):１６９￣１７２.[７]㊀ＲＡＭＯＳＡꎬＳＡＮＣＨＩＳＶꎬＭＡＲÍＮＳ.Ｔｈｅｐｒｅｈｉｓｔｏｒｙｏｆｍｙｃｏｔｏｘ￣ｉｎｓ:Ｒｅｌａｔｅｄｃａｓｅｓｆｒｏｍａｎｃｉｅｎｔｔｉｍｅｓｔｏｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎｓ.[Ｊ].ＷｏｒｌｄＭｙｃｏｔｏｘｉｎꎬ２０１１(４):１０１￣１１２.[８]㊀李正辉ꎬ向晶晶ꎬ陈婧鸿ꎬ等.小麦赤霉病拮抗菌的分离与鉴定[Ｊ].麦类作物学报ꎬ２００７ꎬ２７(１):１４９￣１５２.[９]㊀韩青梅ꎬ曹丽华.小麦赤霉病的生物防治研究进展[Ｊ].麦类作物学报ꎬ２００３ꎬ２３(３):１２８￣１３１.[１０]成丽霞ꎬ彭㊀兵ꎬ李天金ꎬ等.一株具有广谱抗真菌活性细菌菌株的分离鉴定及拮抗物的理化特性[Ｊ].微生物学通报ꎬ２００９ꎬ３６(３):３６５￣３７０.[１１]ＳＴＵＲＺＡＶꎬＣＨＲＩＳＴＩＥＢＲꎬＮＯＷＡＫＪ.Ｂａｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ:Ｐｏ￣ｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｓｙｓｔｅｍｓｏｆｃｒｏｐｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０００ꎬ１９(１):１￣３０. 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黑水虻蛋白的乳酸菌发酵特性及其对鸡免疫功能的影响
4522023黑水虻蛋白的乳酸菌发酵特性及其对鸡免疫功能的影响阮传清福建省农业科学院农业生物资源研究所福州350003摘要制备黑水虻(Hermetia illucens L.)乳酸菌发酵制品，促进该昆虫蛋白在动物养殖中的应用。
将黑水虻通过匀浆机去除体壁，获得蛋白匀浆，并调至pH7.0。
观察蛋白匀浆的巴氏灭菌处理及乳糖添加量对干酪乳杆菌发酵的影响，并用酶联免疫法测定日粮中添加蛋白匀浆乳杆菌发酵物对鸡免疫功能的影响。
结果表明，经巴氏灭菌（65℃、30min）的蛋白匀浆更有利于干酪乳杆菌的生长。
在试验范围内，随着蛋白匀浆乳糖添加量的增加，发酵液的干酪乳杆菌含量加大，pH降低，酸度值升高。
当乳糖添加量为3%时，发酵液干酪乳杆菌含量达1.16×109cfu/mL，pH5.01，酸度271.17o T。
在日粮中拌入10%质量比黑水虻蛋白匀浆乳酸菌发酵物，肉鸡的免疫球蛋白IgA、IgG显著提高，但IgM含量无显著性变化。
关键词黑水虻干酪乳杆菌免疫调节文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）02-0006-03Fermentation of black soldier fly protein homogenate with Lactobacillus casei and its effects on chicken immune systemRuan Chuanqing(Agricultural Bio-resource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou350003)Abstract To promote the application of black soldier flies(Hermetia illucens L.)in animal breeding,the fermintaion of Lactobacillus casei in the protein homogenate of the insect was studied.The protein homogenate of the insect was obtained by homogenizing the in鄄sect larvae with the tegument removed,and adjusted to pH7.0.The effects of the pasteurization and lactose addition were studied on the fermentation of Lactobacillus casei in the insect protein homogenate.The effect of the proteins homogenate fermented by L.casei on the immune function of chickens was also determined by enzyme-linked immunosorbent assay.The results showed that the pasteur鄄ized(65℃,30min)protein homogenate benefited the growth of L.casei in it.As the increase of lactose added in the pasteurized ho鄄mogenate within the experimental range,the fermentation broth of the homogenate by L.casei increased in the content of the bacteria and acidity with the decreasing pH value.At the lactose addition of3%,the content of L.casei in the fermentation broth reached 1.16×109cfu/mL,the pH valued5.01,and the acidity271.17o T.The fermented homogenate was mixed into chicken diet by10%,the immunoglobulin IgA and IgG of broiler chickens increased significantly,but the content of IgM did not change significantly.Key words Black soldier fly Lactobacillus casei Immune regulation黑水虻，学名亮斑扁角水虻（Hermetia illucens L.)，是一种重要的资源昆虫。
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对6种环境生物的急性毒性
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对6种环境生物的急性毒性游泳;林涛;李建宇;史梦竹;郑丽祯;傅建炜;魏辉【摘要】甲氨基阿维菌素苯甲酸盐是一种新型的抗生素类杀虫剂、杀螨剂，其大量使用可能会导致一系列的生态风险，因此有必要开展其对相关环境生物毒性的研究。
测定了甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对意大利蜜蜂、日本鹌鹑、斑马鱼、家蚕、大型溞和赤子爱胜蚓6种非靶标生物的急性毒性。
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对蜜蜂的急性经口LC50（48 h）为0．555 a．i．mg・ L-1，对鹌鹑的经口LD50（7 d）为148．369 a．i．mg・ kg-1，对斑马鱼的LC50（96 h）为0．368 a．i．mg・ L-1，对家蚕的急性摄入毒性LC50（96 h）为0．005 a．i．mg・ L-1，对大型溞的运动抑制毒性EC50（48 h）为0．020 a．i． mg ・ L-1，对蚯蚓的急性毒性LC50（14 d）为18．397 a．i．mg・ kg-1。
该农药对家蚕和大型溞均为剧毒，对蜜蜂和斑马鱼均为高毒，对鹌鹑中毒，对蚯蚓低毒。
总体而言，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对环境生物危害大，在使用过程中要注意。
%Background Emamectin benzoate is a novel antibiotic insecticide and acaricide .Its extensive use may lead to serious ecological risks .It is necessary to evaluate its biological toxicity in relation to untargeted species .[Method]The acute toxicity of 5% emamectin benzoate on six representative untargeted species , i.e.honeybee ( Apis mellifera) , Japanese quail ( Coturnix japoni-ca) , zebra fish ( Danio rerio) , silkworm ( Bombyx mori) , Daphnia magna and earthworm ( Eisenia fetida) , was tested in laborato-ry.[Result]The results showed that the LC50(48 h) for acute oral toxicity (microemulsion) on bee was 0.555 a.i.mg・ L-1(high-lytoxic).The LD50(7 d) for quail was 148.369 a.i.mg・ kg-1(moderately toxic);the LC50(96 h) for zebra fish was 0.368 a.i. mg・ L-1;the LC50(96 h) for silkworm was 0.005 a.i.mg・ L-1(extremely toxic), the EC50(48 h) for Daphnia magna was 0.020 a.i.mg・ L-1(extremely toxic);and the LC50(14 d) for earthworm was 18.397 a.i.mg・ kg-1(weakly toxic).[Conclusion and significance]In general, the emamectin benzoate can be considered of high risk to untargeted organisms and should be used with caution .【期刊名称】《生物安全学报》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】6页(P40-45)【关键词】甲氨基阿维菌素苯甲酸盐;环境生物;急性毒性【作者】游泳;林涛;李建宇;史梦竹;郑丽祯;傅建炜;魏辉【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013【正文语种】中文甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)，化学名称4′-脱氧-4-表甲氨基阿维菌素B1苯甲酸盐，是1984年美国Merk & C.公司(Demchak &Dybas,1997)对阿维菌素进行衍生化合成，1994年又经优化改进开发得到的半合成农药品种，是一种新型的抗生素类杀虫剂、杀螨剂。
三所国家级农业科学研究院介绍
三所国家级农业科学研究院介绍河南省科学院商飞飞中国农业科学院——中国农业科学院是国家级综合性农业科研机构，担负着全国农业重大基础与应用基础，应用研究和高新技术研究的任务。
全院共有39个研究所（中心），1个研究生院，1个中国农业科学技术出版社。
在39个研究所中，从事种植业研究的有16个，养殖业10个，经济、环境资源8个，农业工程和高新技术5个。
有24个研究所分布在全国16个省（市、区）。
全院建有2个国家重大科学工程，5个国家重点实验室，32个农业部重点开放实验室，52个中国农业科学院重点开放实验室；15个国家农作物、畜禽改良中心，1个分中心；5个国家重点野外科学观测试验站，24个农业部野外台站；5个国家工程技术研究中心，5个国家工程实验室和工程研究中心；3个国家质检中心，37个部级质检中心；1座国家农作物种质资源长期库，10座中期库，12座国家农作物圃；1座馆藏文献210万余册，33万余种的国家农业图书馆，建有数据量80G以上的大型农业科学数据库。
∙作物科学研究所（北京）∙植物保护研究所（北京）∙蔬菜花卉研究所（北京）∙农业环境与可持续发展研究所（北京）∙北京畜牧兽医研究所（北京）∙蜜蜂研究所（北京）∙饲料研究所（北京）∙农产品加工研究所（北京）∙生物技术研究所（北京）∙农业经济与发展研究所（北京）∙农业资源与农业区划研究所（北京）∙农业信息研究所（北京）∙农业质量标准与检测技术研究所（北京）∙农业部食物与营养发展研究所（北京）∙研究生院（北京）∙中国农业科学技术出版社（北京）∙农田灌溉研究所（河南新乡）∙中国水稻研究所（浙江富阳）∙棉花研究所（河南安阳）∙油料作物研究所（武汉）∙麻类研究所（长沙）∙果树研究所（辽宁兴城）∙郑州果树研究所∙茶叶研究所（杭州）∙哈尔滨兽医研究所∙兰州兽医研究所∙兰州畜牧与兽药研究所∙上海兽医研究所∙草原研究所（呼和浩特）∙特产研究所（吉林吉林）∙环境保护科研监测所（天津）∙沼气科学研究所（成都）∙南京农业机械化研究所（南京）∙烟草研究所（山东青州）∙柑桔研究所（重庆）∙甜菜研究所（哈尔滨）∙蚕业研究所（江苏镇江）∙农业遗产室（南京）∙水牛研究所（南宁）∙草原生态研究所（兰州）∙家禽研究所（江苏扬州）∙甘薯研究所（江苏徐州）中国水产研究院——农业部直属的综合性渔业科研机构，作为国家级水产科研机构，担负着全国渔业重大基础、应用研究和高新技术产业开发研究的任务，在解决渔业及渔业经济建设中基础性、方向性、全局性、关键性重大科技问题，以及科技兴渔、培养高层次科研人才、开展国内外渔业科技交流与合作等方面发挥着重要的作用。
“闽牧6号”狼尾草的选育及田间种植技术
“闽牧6号”狼尾草的选育及田间种植技术陈钟佃;黄勤楼;黄秀声;冯德庆;钟珍梅【摘要】“闽牧6号”狼尾草是通过辐射杂交狼尾草杂种F1种子诱变和田间双重筛选选育的狼尾草新品种,杂交狼尾草F1种子为美洲狼尾草不育系Tift23A为母本和象草N51为父本配制的种间杂交种,为三倍体杂种,其染色体数为3n=21,其中7条染色体来自美洲狼尾草,14条来自象草.“闽牧6号”狼尾草鲜草产量高(最高可达348 400 kg/hm2)、品质优(粗蛋白质15.30％)、茎叶比低(0.56),在福建省3～9月均可用茎节繁殖,株行距以50 cm×50cm或40 cm×60 cm为宜.为获得高产,每次刈割后要及时追肥,“闽牧6号”狼尾草极少有病虫害发生,偶见蚜虫,其鲜草适合饲喂牛、羊等草食动物,也可青贮利用,还可打浆适量饲喂生猪,多余的青草晒制后也可替代稻草栽培双孢蘑菇.%Minmu-6 is a new variety of pennisetum produced through radiation breeding of hybrid Fl and double screening in the field, which has the characteristics of high yield (the maximum 348400kg/ hm2) , superior quality( CP 15. 30%) and low ratio of stem and leaf(0. 56). In Fujian province, it can be reproduced with eustipes from March to S eptember, with a 50cm×50cm or 40cm×60cm spacing. In order to gain high yield, manure should be added after each mowing. Minmu-6 is less likely to be damaged by diseases and insects with an exception of accidental aphis. Its fresh grass can be either fed to cattle and sheep or stored in addition to feeding the pig by pulping with the diet, and the additional grass after sun-curing can be used to plant Agaricus bisporus instead of straws.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】3页(P53-55)【关键词】闽牧6号;辐射育种;种植技术【作者】陈钟佃;黄勤楼;黄秀声;冯德庆;钟珍梅【作者单位】福建省农业科学院农业生态研究所福建省山地草业工程技术研究中心;福建省丘陵地区循环农业工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院农业生态研究所福建省山地草业工程技术研究中心;福建省丘陵地区循环农业工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院农业生态研究所福建省山地草业工程技术研究中心;福建省丘陵地区循环农业工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院农业生态研究所福建省山地草业工程技术研究中心;福建省丘陵地区循环农业工程技术研究中心,福建福州350013【正文语种】中文【中图分类】S811.6狼尾草(Pennisetum)属牧草是热带、亚热带和温带地区的重要牧草，生长速度快，生物产量高，是草食家畜的优质饲料和淡水鱼类的青饵料[1-3]。
利用CRISPR
颜静宛，陈子强，周淑芬，等．利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制水稻品种ＧＷ２基因的突变体［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（３）：７３－７８．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０３．０１１利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制水稻品种ＧＷ２基因的突变体颜静宛，陈子强，周淑芬，王 锋（福建省农业科学院生物技术研究所／福建省农业遗传工程重点实验室，福建福州３５０００３） 摘要：培育具有育种价值的ＧＷ２基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术，以生产上广泛推广应用的１３份水稻品种为材料，对粒质量基因（ＧＷ２）进行定向性状改良，通过农杆菌转化创制出一批无Ｔ－ＤＮＡ元件的水稻非转基因ＧＷ２突变纯合株系。
结果表明：１３份Ｔ０代水稻转基因中，有２８．０％～５９．１％植株的ＧＷ２基因发生了突变，纯合突变株数量占总突变株数量的３５．０％，双等位突变株数量占总突变株数量的１４．２％，杂合突变株数量占总突变株数量的５０．８％。
此外，不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。
对１３份Ｔ２代非转基因水稻ＧＷ２突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。
与对应的野生型亲本品种相比，纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高１０．８１％～５８．２２％。
本研究结果极大地丰富了ＧＷ２的突变类型，为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源，同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。
关键词：水稻；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；基因编辑；粒质量；ＧＷ２基因；突变 中图分类号：Ｑ３４４＋．１４；Ｓ５１１．０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０３－００７３－０６收稿日期：２０２３－０４－０８基金项目：福建省科技计划———省属公益类科研院所基本科研专项（编号：２０２０Ｒ１０２７００８）；福建省农业高质量发展超越“５５１１”协同创新工程（编号：ＸＴＣＸＧＣ２０２１００２）。
一个水稻Bowman-Birk家族基因功能的研究
一个水稻Bowman-Birk家族基因功能的研究颜静宛;林智敏;苏军;宋亚娜;胡太蛟;王锋【摘要】采用荧光定量分析和过量表达的方法研究水稻Bowman-Birk家族基因BBTI-13基因的功能.结果显示,BBTI-13在野生型日本晴水稻中具有组织特异性,在胚和花药中表达最低;BBTI-13基因的烟草亚细胞表达定位表明其为组成型表达;过表达株系的田间表型分析发现,过表达转基因植株与野生型相比株型矮化,粒型稍变大.并通过对水稻株形矮化相关基因的表达进一步分析表明,BBTI-13基因的过量表达会引起水稻相关矮化基因的上调和下调反馈,其中Ghd2、DTH7、Ghd7、THIS1和Ghd8表现上调,OsBZR1、OsSIN表现下调.【期刊名称】《泉州师范学院学报》【年(卷),期】2018(036)006【总页数】5页(P20-24)【关键词】水稻;Bowman-Birk;基因克隆;功能分析【作者】颜静宛;林智敏;苏军;宋亚娜;胡太蛟;王锋【作者单位】福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院生物技术研究所农业遗传重点实验室,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】Q789Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk inhibitors, BBTI)是一类丝氨酸蛋白酶抑制剂, 广泛分布在各类植物中，包括豆科、禾本科和菊科, 在单子叶植物和双子叶植物中广泛分布的蛋白酶具有抑制作用[1-3].其中,双子叶植物型BBTI为双头，大小为8 ku；单子叶植物型BBTI可分为两类，单头8 ku和双头16 ku[4-5]. 目前,水稻基因组中BBTI家族具有13个成员，其中BBTI-9不被转录表达，BBTI-10被错误翻译[6].BBTI基因家族成员在水稻种子萌发过程中表现出不同的表达模式，伤口对水稻BBTI转录表达也有影响[7].目前,水稻中关于BBTI基因的功能报道主要集中在植物防御方面，包括BBTI2-3能抑制胰蛋白酶和一种水稻稻瘟病原菌[8]，以及OsW1P1基因能被病原菌(pseudomonas avenae) 诱导表达[9].本研究从日本晴野生型水稻中克隆BBTI-13基因，通过构建过表达载体和农杆菌转化，田间表型调查表明BBTI-13过表达转基因植株造成水稻表现矮化，采用实时荧光定量PCR检测BBTI-13在日本晴中的组织特异性和一些水稻株高相关基因的表达分析，以期阐明BBTI-13基因对水稻的影响机制，为将来深入研究Bowman-Birk家族基因在水稻中的分子机制奠定基础.1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 主要试剂与材料 TaqDNA聚合酶和总RNA提取采用的试剂盒(RNAprep pure Plant Kit，CAT：DP432)购自北京天根生物科技有限公司，反转录试剂(Invitrogen)购自美国Thermo Fisher公司；荧光染料(SYBR Premix EX TaqTM)购自takara公司.引物合成由福州擎科生物技术有限公司完成.1.1.2 供试水稻材料及农杆菌菌种本研究供试野生型材料为日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare).农杆菌菌株为LBA4404；过表达载体pCXUN 为本实验保存.所有材料种植在福州寿山国家转基因基地28 ℃温室大棚内.用于RT-PCR水稻材料，如根、茎、叶、颖壳、穗梗、花药、胚和胚乳，在水稻灌浆期后15 d液氮取样后贮存于-80 ℃下备用.1.2 方法1.2.1 RNA分析所有组织RNA提取采用RNAprep pure Plant Kit提取试剂盒(北京天根，Code:DP432)，反转录合成cDNA的第一条单链(Fermentas公司).1.2.2 过表达载体构建及农杆菌转化通过PCR扩增获得BBTI-13(LOC_Os03g60840) 编码序列(cDS) 全长，根据水稻数据库 (rice genome annotation project) 的序列信息设计特异性引物，扩增体系：10×PCR buffer 5μL, 2.5 mMdNTPs 0.1 μL, cDNA模板50～100 ng，10 μM引物B1各2 μL，KOD DNA Polymerase 2.5 U，不足补水至50 μL.反应程序为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，58.5 ℃ 30 s,68 ℃ 45 s， 35个循环；68 ℃ 5 min，4 ℃ 保温.PCR 产物在1.5%琼脂糖胶回收，加尾后，与pCXUN质粒片段(XcmI酶切回收)克隆.挑选单克隆，摇菌送福州擎科生物技术有限公司完成测序.农杆菌水稻转化方法参照本实验室操作方法[10].1.2.3 转基因后代T0植株的PCR检测采用CTAB法[11]抽取水稻叶片DNA.设计潮霉素筛选标记引物hpt1和hpt2，进行PCR扩增.扩增体系为25 μL：10×天根buffer 12.5 μL，(10 μmol)引物1和引物2各2 μL， 50 ng DNA为2 μL，Taq 酶0.5 μL，不足补ddH2O至25 μL.反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保温.1.2.4 烟草BBTI-13基因亚细胞定位载体的构建及农杆菌转化本氏烟将BBTI-13全长cDS与GFP融合后构到pCXSN表达载体，得到重组质粒35S：BBTI13-GFP，包括CaMV35S启动子，终止子为NOS.采用热击方法转化大肠杆菌DH5a，37 ℃ LB培养，挑单落送福州擎科生物技术有限公司测序.采用电击方法将测序正确质粒35S:BBTI13-GFP转化GV3301菌，28 ℃含有Rif (25 mg/L)和苄那霉素(50 mg/L)YEB培养基划板培养，挑单菌落摇菌甘油保存-80 ℃.将转入了BBTI-13基因表达载体的GV3301菌单菌落在28 ℃含有Rif(25 mg/L)和苄那霉素(50 mg/L)LB暗条件下培养至OD600值为0.8，离心机(4 500 r/min) 离心收集10 min.用含有终浓度为10 mmol/L MgCl2，10 mol/L MES (pH 5.8)和200 μmol/L 乙酰丁香酮(AS)的无菌水重新悬浮，将菌液浓度调至OD600约0.8，室温下静置2～4 h备用.用1 mL一次性注射器在本氏烟叶背面将农杆菌缓慢注射入叶片组织空隙.3 d后，在激光共聚焦显微镜下进行显微观察.利用打孔器将瞬时表达的本氏烟幼苗打出0.5 cm×0.5 cm大小，并将其放在干净的载玻片，盖好盖玻片，边缘封口.设置激发光波长488 nm，发射光波长520～550 nm，置于激光扫描共聚焦显微镜下扫描拍摄，观察其GFP绿色荧光在本氏烟叶片内的分布情况.1.2.5 荧光定量Q-PCR检测引物设计选取β-Actin作为水稻基因表达的内参基因，Q-RT PCR的反应体系为：cDNA为1 μL, 基因特异引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBGreen Mix 10 μL,ddH2O 8 μL，总体系20 μL.反应程序为：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40个循环.每个样品设立3个重复，结果取其平均值.所有引物见表1.表1 引物序列Tab.1 Primers sequence引物名称引物序列引物名称引物序列B13F5'ATGAGGAGCAGCTCGGCTCTGTTCT3'Ghd8F5'AGGAGTGCGTGTCGGA GTTCAT3'B13R5'TCAGCGGGCGGCGGCGGTGCACGG3'Ghd8R5'CGGTAGCG GTTGAGGTAGGACT3'Hpt15'TACACAGCCATCGGTCCAGA3'DTH7F5'CTGTC GAAGGTCATGCTGCCAACT3'Hpt25'TAGGAGGGCGTGGATATGTC3'DTH7R5'CCACTGCCGCTTCCACTTCCATT3'ActinF5'AACATCGTTCTCAGTGGTGG3'Ghd 7F5'GAGGAAGAAGAGGTGCTACGAGAAG3'ActinR5'CCAGACACTGTACTTCC TTTCA3'Ghd7R5'CCATTGTCCAAGCTCAAGCCTACTA3'OsBZR1F5'CCAAGCA CTGCGACAACAACGAGGT3'Ghd2F5'CGCATCCTCATCGTGCTTCAAG3'OsBZR 1R5'ACGATGGCGGCGGCTTACATCCCTT3'Ghd2R5'GTCCGAGTAGGGCTTCC ATGTC3'OsSINF5'CAGAGGAGGCTGGTGTACGT3'THIS1F5'TAATTGCTCCACC ACCACCACCACT3'OsSINR5'ACATGTGGGTGGAGCGGAAG3'THIS1R5'CTCCA TGCCATCCGACCACCATTG3'2 结果与分析2.1 BBTI-13基因在水稻中的组织特异性表达分析为了确定BBTI-13在水稻中的不同组织中的表达量，分别提取日本晴野生型水稻的根、茎、叶、穗梗、花药、颖壳、胚和胚乳的总RNA，反转cDNA后荧光定量PCR检测分析结果表明，其在各个组织器官中表达差异显著，在叶片中的表达相对较高，而在花药和胚中的表达最低(图1).图1 BBTI-13基因在不同器官的相对定量表达分析图2 水稻DNA基因组PCR检测 Fig.1 Expression of BBTI-13 in various organs analyzed by QRT-PCR analysis Fig.2 PCR detection of rice DNA genome2.2 过表达水稻株系T0代转基因筛选标记PCR分子检测农杆菌介导转化后，以转化质粒做为阳性对照，对转基因后代植株提取DNA检测载体上筛选标记潮霉素(hyg)基因PCR检测表明，经过表达载体质粒pCXUNB13转化获得8个阳性过表达株系，2个阴性株系(图2).2.3 BBTI-13基因烟草激光扫描共聚焦显微镜观察采用农杆菌瞬时转化烟草叶片方法，将35S:BBTI13-GFP亚细胞表达载体注射到本氏烟幼菌(21 d菌龄)叶片中，25 ℃室温培养3 d，制片后在激光共聚焦显微镜下扫描拍聚，结果(图3)显示，绿色荧光在叶片表皮细胞的各个器官显组成型表达，与阳性对照35S:GFP是一致的.图3 BBTI-13基因烟草亚细胞定位图4 过表达阳性株系BBTI-13基因的表达分析 Fig.3 Subcellular localization of BBTI-13 protein Fig.4 Expression analysis of BBTI-13 gene in over-expression positive rice2.4 BBTI-13基因在转基因植株中的表达分析选取BBTI-13过量表达阳性3个株系进行荧光定量PCR表达分析，结果表明，与野生型日本晴相比(图4)，3个阳性株系的表达量均明显提高，其中OV-1这个株系BBTI-13上调幅度最大.2.5 BBTI-13过表达转基因株系的表型分析田间表型调查对比表明，相比野生型(WT)，BBTI-13过表达植株表现直立、矮化性状(图5)，而随生育期推移，其矮化性状越发明显.同时,过表达水稻植株的穗型变短小，谷粒大小较野生型宽度变得稍微大点.2.6 转基因植株中矮化相关基因的表达分析分析过表达转基因植株的表型，选择目前与株高相关的7个基因，对过表达阳性株系OV-1进行实时荧光定量表达分析，结果(图6)表明，它们在BBTI-13过表达OV-1株系中都受到上调或下调的反馈，其中Ghd2、DTH7、Ghd7、THIS1和Ghd8表现上调，OsBZR1、OsSIN表现下调.因此说明BBTI-13基因不仅调控水稻株型，而且与一些株高基因存在一定的纽带联系.图5 BBTI-13过表达基因的表型分析图6 野生型和BBTI-13中株高相关基因表达水平分析Fig.5 The phenotype analysis of BBTI-13 over-expressed genes in rice Fig.6 Comparison of height-related gene expression between WT and BBTI-133 结论目前,与水稻矮化相关的一些重要性状基因包括OsBZR1是油菜素内酯信号传导下和下游信号分子，是一个重要的矮秆基因[12]. OsSIN的过量表达导致水稻节间变短[13].Ghd8被证实能够调控水稻的产量、株高[14].DTH7是一个可以控制株高等，并受光周期调控[15].Ghd7基因位点，是一个能同时控制水稻每穗粒数、株高和抽穗期3 个性状的主效QTL[16].Ghd2过表达植株每穗粒数、株高和抽穗期显著增加[17].THIS1表现出多分蘖、株高变矮以及小穗不育等表型[18].水稻基因中有13个Bowman-Birk家族基因，但大多数这类胰蛋白酶抑制剂的在水稻中的具体功能未见报道，尤其是与水稻矮化相关.本文为了揭示其BBTI-13基因参与水稻生殖发育，克隆了BBTI-13基因.首先，荧光定量表达分析表明，BBTI-13基因在水稻日本晴野生型水稻的不同组织中表现出组织特异性表达，其中以叶片中表达最强，在胚和花药中的表达最低.其次，通过构建过表达载体和烟草亚细胞定位表达载体，结果表明其BBTI-13基因在细胞中各组织组成表达，但当过量表达载体转化水稻后，其后代转基因植株中BBTI-13基因获得过量表达，而且田间表型调查发现其过量表达直接引起水稻产生矮化性状表型；进一步的表达定量分析表明，BBTI-13基因在水稻中的过量表达对水稻的矮化基因具有一定的反馈作用，引起它们的上、下调变化.因此，通过揭示BBTI-13基因在水稻中的功能，将对后续研究Bowman-Birk家族基因在水稻中的功能作用奠定一定的研究基础.参考文献：【相关文献】[1] BIRK Y.The Bowman-Birk inhibitor.Trypsin and chymotrypsin-inhibitor fromsoybeans[J]. 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省农业科学院
28.5
10.47
王锋
新型安全转基因水稻培育技术研究
院创新团队
19
10.48
苏军
抗同翅目害虫基因的挖掘、改造及其在水稻中的应用
院创新团队
23
10.49
林晨韬
ELISPOT技术检测嗜水气单胞菌疫苗免疫欧洲鳗鲡的免疫反应
省农科院
4
10.32
许斌福
水产病害控制技术示范推广
福建省农科院
5
10.33
王锋
水稻分子设计科技创新团队
福建省农科院
10
10.34
蔡宣梅
特种中药材繁殖技术研究
福建省花卉盆景公司
7
10.35
陈松彪宋亚娜
植物分子免疫科技创新团队建设
福建省农业科学院
15.0
10.36
许斌福
海水鱼弧菌病原库的建立与管理
福建省农科院
3
院青年创新基金
0.7
10.42
欧阳桐娇
球根花卉试管鳞茎抽薹技术研究
福州市科技局
10
10.43
田大刚
我国水稻主栽品种Pi2/Pi9抗病位点的基因分型及功能标记开发
福建省农业科学院
3
10.44
颜静宛
基于化学诱导重组系统的高效无选择标记转基因水稻培育体系的建立
院科研项目B类
2
10.45
陈松彪
水稻抗稻瘟病分子机制研究及广谱抗病水稻分子设计
省自然科学基金
5
10.20
陈叙
嗜水气单胞菌DNA疫苗免疫欧洲鳗鲡的初步研究
省自然科学基金
5
10.21
林晨韬
ELISPOT技术检测创伤弧菌疫苗免疫欧洲鳗鲡的免疫反应
福建省自然科学基金
5
10.22
宋铁英
动物营养免疫调控技术集成及功能性饲料开发
福建省科技厅
100
10.23
陈睿
水稻OsMGA15基因在花粉发育中的功能分析
省属公益类专项
8
10.12
方少忠
百合小鳞茎抽苔调控研究
省属公益类专项
8
10.13
陈彬
闽江流域病原性大肠杆菌整合子的研究
省自然基金
5
10.14
陈秀霞
皂甙类免疫佐剂的筛选及其在福建省主要经济鱼类养殖中的应用
省属公益类专项
8
10.15
郑在予
欧洲鳗鲡和大黄鱼体细胞系模型建立及其应用
省属公益专项
8
10.16
陈坚
10生物所科研项目计划清单
序号
主持人
项目名称
项目来源
经费
（万元）
10.1
方勤美
雷公藤、短葶山麦冬新资源食品特征研究及成份分析
国家科技部支撑计划子课题
25.2
10.2
陈松彪
稻瘟菌效应因子的规模化鉴定和功能分析
国家自然科学基金
60
10.3
陈叙
创伤弧菌DNA疫苗免疫欧洲鳗鲡的研究
国家自然科学基金
20
10.4
水稻转录因子SUSIRI基因的过表达及RNAi对水稻生育性状的影响研究
省自然基金项目
5
10.17
朱炳耀
草莓良种资源收集利用与分子标记技术研究
省公益类专项
8
10.18
杨绍华
水稻OsMGA1基因的克隆及其在花粉发育过程中的功能分析
省自然科学基金
5
10.19
胡昌泉
一个水稻胚乳特异表达寡肽转运蛋白的功能研究
8
10.28
陈曦
猪流行性腹泻病毒野生变异株P55全基因序列测定
省农科院
3
10.29பைடு நூலகம்
林艳
调控脂肪酸代谢转录因子WRI1转化水稻的初步研究
省公益类科研院所专项
8
10.30
柯翎
刺激隐核虫的抑动抗原的单抗制备和血清型研究
省科技厅
3
10.31
方勤美
迟缓爱德华氏菌侵染鳗鲡肝细胞后蛋白质组学的差异变化
福建省科技厅
陈叙
鱼类DNA疫苗免疫应答的机理研究
福建省农科院
50