细菌内毒素 - 理论
细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析
细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
细菌内毒素
细菌内毒素
细菌内毒素是一种由细菌分泌的有毒物质。
它主要由细菌的细胞壁、胞外膜或细胞内产生，并在细菌感染或死亡时释放出来。
细菌内毒素的化学结构和生物活性因细菌种类而异。
它们可以直接伤害宿主细胞，引发免疫反应或导致中毒。
一些细菌内毒素可以穿透宿主细胞膜，并干扰细胞内代谢和信号传导通路，导致细胞功能异常甚至死亡。
细菌内毒素可以引起许多疾病，包括细菌感染引起的疾病如脓毒症、痢疾以及肺炎等。
它们还可能导致食物中毒、肠胃炎和其他细菌相关的疾病。
针对细菌内毒素的治疗方法包括抗生素治疗、中和细菌内毒素的抗体和免疫疗法，以及相关的疫苗预防措施。
需要注意的是，某些细菌内毒素具有非常强的毒性，可能对人类和动物的健康造成严重威胁。
因此，对细菌内毒素的研究和监测非常重要，以便及时采取控制和预防措施。
细菌内毒素ppt
细菌内毒素标准品的稀释
➢ CP2010年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡 混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前要 至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求；
➢ 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀 分布
➢ 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效 价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝 等不正确的实验结果
2、将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素 检查用水溶解 ，在旋涡混合器上混匀15分钟 ，然后根据 鲎试剂标示灵敏度(λ)，制成 2λ、λ、0.5λ和0.25λ4个 浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上 混匀30秒钟。
示例 某待复核的鲎试剂的灵敏度标示值为0.25EU/ml， 细菌内毒素工作标准品规格为150EU/ml，将细菌内毒素工 作标准品用1ml检查用水溶解，再稀释制备成浓度为 0.50EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml，和0.0625EU/ml的细 菌内毒素标准溶液。
试验中所用的器皿，需要经过处理，除去 可能存在的外源性内毒素。常用的方法是 250℃干烤至少30分钟，达到规定时间后， 关断电源，待烤箱温度自然降至室温，一 般约需6～8 小时。 也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰 细菌内毒素的检查。
除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内 使用，否则须再次除去可能存在的外源性 内毒素。
细菌内毒素检查
主要内容
细菌内毒素检查相关理论及概念
细菌内毒素 实验原理 实验试剂 实验器具
细菌内毒素检查法及注意事项
供试品溶液的制备 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数（MVD）的确定 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验 凝胶限度试验
细菌内毒素
➢ 细菌内毒素主要存在于革兰阴性菌细胞壁 的最外层，当细菌死亡、裂解后才释放出 来。
细菌内毒素知识
从示意图我们可 以知道： 细菌内毒素不是 细菌或细菌的代 谢产物，而是细 菌死亡或裂解后 才释放出来的一 种具有生物活性 的物质
1. 细菌内毒素的定义
•1.3 脂多糖的组成
◆脂质A（Lipid A）： •糖磷脂。是细菌内毒素生物学活性的主要组分，无种属特 异性。 ◆核心多糖(core polysaccharide)：位于脂质A的外层，有种 属特异性。 ◆特异多糖(specific polysaccharide)：由数个至数十个低聚 糖重复单位组成的多糖链。具有种属特异性。革兰氏阴性菌 的菌体抗原（O 抗原）
所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度； ◆ c 为供试品溶液的浓度，
当L 以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml， 当L以EU/mg 或EU/U 表示时，c 的单位需为mg/ml 或U/ml。 如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试
品的最小有效稀释浓度c=λ/L。
谢谢大家！
3. 超滤法 可基于产品的分子量，选择合适的超滤膜进行处理，考虑到内毒素的聚 集的多变性，选用超滤法除蛋白溶液内毒素，并不是很合适的。
5. 细菌内毒素的去除方法
5.2 化学降解法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具、配 液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或氢氧化 钠（如0.5M NaOH处理30min）处理，破坏热原。
6. 细菌内毒素的检测方法
6.3 确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不 超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定：
MVD=cL/λ
式中： ◆ L 为供试品的细菌内毒素限值；
◆ λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中
细菌内毒素结论
细菌内毒素结论细菌内毒素是一种透过细菌细胞壁释放至外部的有毒分子，它可以引发机体的炎症、凝血和脏器损伤等不良反应。
研究表明，细菌内毒素是引发严重感染（如脓毒症）的主要原因之一，其流感毒素、大肠杆菌毒素、痢疾杆菌毒素等常见病原体毒素已经被广泛研究。
尤其在感染疾病治疗中，对细菌内毒素的研究已成为重要的研究方向之一。
细菌内毒素的结构、生产和释放：细菌内毒素是由革兰氏阴性菌所产生，它主要是由中央毒素结构的脂多糖（LPS）所组成。
LPS是细胞壁中的一个组分，它结合在细菌SC层（荚膜）的表面并形成一个外层膜。
具体来说，LPS由三部分组成：O抗原、中央核心部分和脂肉类A内核外毒素（Endotoxin）。
其中，Endotoxin是LPS的主要成分，它可以释放到体内产生毒性反应。
此外，某些细菌还可以分泌外毒素（Exotoxin），明显产生毒性作用。
Endotoxin经过吸收和分解后，分解产物可以通过胆汁排出体外，引起胆汁淤积和胆石症。
细菌内毒素在感染疾病中的作用：在感染疾病中，细菌内毒素会引起机体严重的炎症反应，进而导致休克、败血症等多种疾病。
实验室研究证明，当Endotoxin作用于大量脐带、侧十二指肠黏膜、靜脉等受体时，会产生严重的内毒素反应。
Endotoxin从受体上提取到细胞内并造成细胞膜的受损，细胞释放出各种炎症介质（如肿瘤坏死因子、白三烯、等等），再引起其他免疫细胞激活，形成一个恶性循环的作用机制。
研究表明，内毒素在肠道中可以改变肠道黏膜的通透性，促进肠道细菌的侵袭，增加肠胃道的感染、内毒素血症、出血、萎缩性肠炎等并发症的风险。
检测细菌内毒素的方法包括：1. LAL法，这是目前常用的检测B类内毒素（Endotoxin）的方法。
2.组织培养，此法通过培养体液或患者组织标本中的细菌来检测Endotoxin，但是它存在收到感染病灶影响的局限性。
3.免疫学检测，其原理是通过检测人体免疫系统对Endotoxin的抗体来确定是否存在内毒素反应等。
细菌内毒素检查法讲义
鲎试剂灵敏度复核试验
内毒素浓度 2λ
● ● 鲎试剂 平行管 ●
λ
0.5λ 0.25λ
阴性对 照
终点
●○ ○
○
λ
●○ ○
○
λ
●● ○
0.5λ
●●● ○
0.5λ
λc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ
如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；
适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有 效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。
例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml
的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度 c ＝0.125 EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml
菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）
热原和内毒素的关系：
热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内
毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是 主要的热原物质，可以说无内毒素就无 热原，控制内毒素就是控制热原。
三、鲎
鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫 (现在 只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出 现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当 时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世， 随着时间的推移，与它同时代的动物或 者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿 多年前问世至今仍保留其原始而古老的 相貌，所以鲎有“活化石”之称。又具 有很高的药用价值。
进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性
内毒素
旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀 释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类 似要求； 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均 匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒 素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对 照不凝等不正确的实验结果
世界上现存鲎的种类
鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。
2 、本试验操作过程应 试验操作过程应防止微 防止微生物和内毒素的 生物的污染 污染
2010版
3 、1EU与1个内毒素国际单 位（IU）相当
2005年版
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4、常用干热灭菌法（250℃、 常用的方法是在250 ℃干烤至少 30分钟以上）去除 60分钟 5、删除 对于过酸、过碱或本身有缓冲能 力的供试品，需调节被测溶液 （或其稀释液）的pH 值，可 使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂 家推荐的适宜的缓冲液调节pH 值。
实验基本流程图
供试品 限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验
供试品干扰实验
结果判断
2. 试剂、仪器设备等
细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。
国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
细菌内毒素工作标准品(CSE)
细菌内毒素工作标准品系以细菌内 毒素国家标准品为基准标定其效价， 用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干 扰试验及各种阳性对照。
仪器设备与实验器具
分析天平 超净工作台 细菌内毒素检查专用干式恒温器 电热恒温干燥箱 旋涡混合器
《细菌内毒素的简介》课件
分泌机制
01
02
03
分泌方式
细菌内毒素通常通过细菌 细胞膜上的通道或出芽方 式分泌到细胞外。
分泌调控
细菌内毒素的分泌受到多 种因素的影响，包括细胞 内的pH值、离子浓度、能 量供应等。
分泌过程
细菌内毒素的分泌过程需 要经过多个步骤，包括内 毒素在细胞内的合成、转 运和分泌到细胞外等。
影响因子与调控方式
制。
03
细菌内毒素的生物合成与分泌 机制
生物合成机制
合成原料
细菌内毒素的生物合成需要特定 的氨基酸和脂质作为原料。
合成酶系
细菌内毒素的合成涉及一系列酶促 反应，这些酶由细菌基因编码。
合成过程
细菌内毒素的生物合成过程包括初 级代谢和次级代谢，其中初级代谢 涉及细胞生长和繁殖，次级代谢则 与内毒素的合成有关。
抑制抗原提呈
内毒素能够抑制抗原提呈细胞对细菌抗原的提呈 ，降低抗原刺激T细胞的效率。
3
诱导免疫抑制细胞因子
内毒素能够诱导免疫抑制细胞因子的产生，如转 化生长因子、白细胞介素10等，从而抑制免疫细 胞的活化和功能。
05
细菌内毒素的检测与防治
检测方法与标准
检测方法
目前常用的细菌内毒素检测方法有鲎试剂法、免疫学检测法 和生物芯片技术等。这些方法具有灵敏度高、特异性强的特 点，能够快速准确地检测出细菌内毒素的含量。
细菌内毒素广泛分布于自然界，主要存在于革兰氏阴性细菌中，如大肠杆菌、 沙门氏菌、志贺氏菌等。
应用领域
细菌内毒素在医学、生物工程、制药等领域具有广泛的应用价值，如用于制备 诊断试剂、疫苗和药物等。
02
细菌内毒素的结构与性质
化学结构
细菌内毒素的化学结构是由多个糖链组成的脂多糖，具有特定的化学组成和排列顺 序。
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细菌内毒素测定
1：试验用的试剂为
1.1内毒素工作品，
1.3鲎试剂灵敏度：λ
1.4细菌内毒素检查用水
1.5 无热源原安剖瓶 5ml/支
2：内毒素限值的确定：
3：样品最大稀释倍数确定
注射液MVD=λCL =鲎试剂灵敏度
内毒素限值样品浓度⨯ （样品浓度按样品规格计算，单位换算为mg/ml ）
大输液MVD=鲎试剂灵敏度内毒素限值⨯=1λ
CL （大输液的浓度都按1mg/ml 计算）
粉针样品稀释最大有限浓度=内毒素限值
鲎试剂灵敏度=L λ
（然后根据样品规格计算出应该稀释的倍数）
4：溶液稀释
4.1样品稀释
样品稀释为比最大稀释倍数的小一倍的样品溶液为T 0和最大稀释倍数的样品溶液为T 1
4.2内毒素工作品稀释：
内毒素工作品根据鲎试剂的灵敏度稀释S 0=4λ,S 1=2λ。
4.3样品阳性对照0.5mlS 0+0.5mlT 0混匀
5：操作步骤
5.1取鲎试剂8支（如有一批样品），分别加入100ul 的检查用水，复溶。
5.2 对照品和供试品
5.2.1阴性对照加入100ul 检查用水
5.2.2阳性对照加入100ulS 0溶液
5.2.3样品加入100ulT 1溶液
5.2.4样品阳性对照加入100ul 样品阳性对照溶液
每个管平行做2支。
6：培养
放入试管恒温仪中37℃，培养60min。
阴性对照、样品应无凝固。
阳性对照、样品阳性对照应凝固，轻轻倒立180°无滑脱。
注：1、安剖瓶用酒精棉将曲颈擦拭消毒后，沿易折点折断。
2、试验完成后，用酒精棉球擦拭工作台面。
3、培养过程中注意防止震动，以免出现假阴性。
4、S1=2λ、S0=4λ。
5、如果同时做几批样品，可以只做2个阳性对照，2个阴性对照。
6、空安剖瓶的最大容积为5ml，在稀释过程中要注意不能使稀释体积过大。
另外还要注意移液器的量程，尽量减少稀释次数。