一种适用于线粒体基因表达分析的cDNA—RAPD方法
RAPD检查方法及意义
RAPD检查方法及意义
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA，是一种利用特定引物与无结构DNA作用，从而扩增出其特異或通用性DNA片段的技术。
它可以扩增出庞大的片段，也可以扩增出裂解服从于经典的单倍体型的微不足道的片段。
RAPD技术借助于PCR（聚合酶链反应）技术，可以仅用少量的DNA，用非特异性引物进行扩增，从而得到很多特定碱基序列，并测定这些片段在不同样本间的差异，有利于生物遗传信息学的研究。
RAPD技术的最大特点之一是能检测大范围内的遗传多态性，可以检测不同的DNA序列，RAPD技术使用的引物一般无特异性，也可以利用这些引物检测基因组中的不同位置的片段，从而在基因组结构与遗传多态性的研究方面，具有很大的潜力。
RAPD技术主要用在生物学的分子标记技术、基因组学、植物种质资源分子识别等方面，在动物育种，植物育种以及遗传改良，在动物种群族群结构研究中。
这种技术可以为鉴定和追踪遗传变异提供快速和高效的证据，为改善品种而进行的育种遗传改良和变异研究提供依据。
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释分子生物学考试重点一、名词解释1、分子生物学(molecular biology)：分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
2、C值(C value)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。
在真核生物中，C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物。
3、DNA多态性(DNA polymorphism)：DNA多态性是指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异。
4、端粒(telomere)：端粒是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，它是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体。
5、半保留复制(semi-conservative replication)：DNA 在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样形成的两个DNA分子与原来DNA 分子的碱基顺序完全一样。
一次，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA 的半保留复制。
6、复制子(replicon)：复制子是指生物体的复制单位。
一个复制子只含一个复制起点。
7、半不连续复制(semi-discontinuous replication)：DNA 复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是中断的、不连续的，因此称为半不连续复制。
8、前导链(leading strand)：与复制叉移动的方向一致，通过连续的5W聚合合成的新的DNA链。
9、后随链(lagging strand)：与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5\T聚合合成的新的DNA链。
10、AP位点(AP site)：所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖昔水解酶，它能特异性切除受损核昔酸上N-B糖昔键，在DNA链上形成去嘌吟或去嘧啶位点，统称为AP位点。
11、cDNA(complementary DNA)：在体外以mRNA 为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
山药基因组DNA的提取和RAPD反应条件的优化
１ ２ ２ ＲＡＰ ． ． Ｄ反应体 系 和程序 的优化
１ ２ ２ １ Ｍｇ 与 ｄ ． ． ． 抖 ＮＴＰ浓 度 对 ＲＡＰ 扩 增 的 影 响 Ｄ
Ｐ Ｒ反应液 中含 １ Ｃ ｕｆｒ １ ａ Ｃ ×Ｐ Ｒ Ｂ ｆｅ ，Ｕ Ｔ ｑ酶 ，０ ｇ模板 ＤＮＡ，０ｐ ｌ Ｌ 引 物 （ Ｐ １ ０ｎ １ ｍｏ ・ Ｏ Ａ一０ ） Ｍｇ ２ ， 抖
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第 ３ ５卷 第 １期
２０ ０ ７年 ２月
河 南师 范 大 学 学报 （ 自然科 学 版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ Ｈｅ ａ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒｉ （ ｔｒ ｌ ｃｅ ｃ ） ｏ ｒ ａ ｎ ｎ Ｎｏ ｍａ ｉｅｓｔ Ｎａ ｕ ａ ｉｎ ｅ ｏ ｙ Ｓ
Ｚ ５ Ｎ０ ．３ ．１
Ｆｅ ２ ｂ． ００７
文章 编 号 ： ０ ０ ３ ７ ２ ０ ） ｌ １ ０ ４ １ ０ —２ ６ （ ０ ７ Ｏ 一０ ４ —０
山药基 因组 ＤＮＡ 的提取 和 ＲＡＰ Ｄ反应 条 件 的优 化
李 明军， 徐 鑫 ， 晓 丽 ， 张 刘永 康
（ 南师范大学 生命科学学院 ， 南 新乡 ４３０ ） 河 河 ５ ０ ７
退火 ４ ， ２ Ｃ 延 伸 ２ｍｉ ， ３ ５ｓ７ ｎ 共 ５个循 环 ； ２ ℃ 终 延 伸 １ ｎ ７ ０ ｍｉ．
关 键词 ： 山药； Ｎ ； Ａ Ｄ 优化 Ａ
山药（ ｏｃｒａｏ ｐ ｓ ａ Ｔ ｕ ｂ ） 又 名薯 蓣 ， Ｄｉｓｏ ｅ ｐ ｏｉ ｈ ｎ ． ， ｔ 为薯 蓣 科 薯 蓣 属 的 一种 药食 兼 优 的植 物 ， 有 健 脾 、 具 固 精、 补肺 、 肾的功 能口 ． 国种质 资源 丰富 ， 益 ］我 生产 实践 中常 以块茎 的形状 为 依 据进 行 分类 ［ ， ２ 也有 使 用 同工 ］ 酶作 为 品种鉴别 的依 据 ， 两种 方法均 存在 较大 的局 限性 ， ］这 利用 分 子标记 从 ＤＮＡ分 子水 平 揭示 品种 间 的
临床检验中的分子诊断技术进展考核试卷
C. Western blot
D. Southern blot
11. 哪种技术可以用于检测单个细胞中的基因表达？（ ）
A. RNA-Seq
B. Single-cell PCR
C. qPCR
D. Northern blot
12. 以下哪种技术不是基于DNA芯片的检测方法？（ ）
A. Microarray
B. SNP array
C. CGH array
D. Western blot
13. 在分子诊断中，以下哪种技术用于检测基因重排？（ ）
A. PCR
B. FISH
C. Southern blot
D. Northern blot
14. 哪种技术可用于检测病原微生物的快速诊断？（ ）
D. PCR
8. 哪种技术被称为下一代测序技术？（ ）
A. Sanger sequencing
B. NGS
C. AFLP
D. RFLP
9. 以下哪个不是NGS技术的优点？（ ）
A. 高通量
B. 成本低
C. 准确性高
D. 速度快
10. 在分子诊断中，以下哪种技术用于检测DNA甲基化？（ ）
A. PCR
C. Western blot
D. Northern blot
19. 哪种技术可以用于检测miRNA的表达？（ ）
A. PCR
B. Northern blot
C. RNA-Seq
D. Western blot
20. 在分子诊断中，以下哪种技术用于检测病毒载量？（ ）
A. PCR
B. ELISA
C. Western blot
RFLP和RAPD技术原理和操作步骤
RFLP和RAPD技术原理和操作步骤原理：DNA分⼦⽔准上的多态性检验测定技术是施⾏基因组研讨的基础。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限⽌断⽚长度多态性)已被⼴泛⽤于基因组遗传图谱构建、基因定位以及有⽣命的物质⾼级演化和分类的研讨。
RFLP是依据不⼀样品种（个体）基因组的限⽌性内切酶的酶切位点碱基发⽣突变，或酶切位点之间发⽣了碱基的插进去、缺失，造成酶切断⽚体积发⽣了变动，这种变动可以经过特别指定探针杂交施⾏检验测定，因此可⽐较不⼀样品种（个体）的DNA⽔准的差别（即多态性），多个探针的⽐较可以稳固建⽴有⽣命的物质的⾼级演化和分类关系。
所⽤的探针为出处于同种或不⼀样种基因组DNA的克隆，位于染⾊体的不⼀样位点，因此可以作为⼀种分⼦标记(马克)，构建分⼦图谱。
当某个性状（基因）与某个（些）分⼦标记协同离合时，表明这个性状（基因）与分⼦标记连锁。
分⼦标记与性状之间交换值的体积，即表达⽬的基因与分⼦标记之间的距离，因此可将基因定位于分⼦图谱上。
分⼦标记克隆在质粒上，可以蕃息及保留。
不⼀样限⽌性内切酶割切基因组DNA后，所切的断⽚类型不同，因为这个，限⽌性内切酶与分⼦标记组成不⼀样组合施⾏研讨。
常⽤的限⽌性内切酶普通是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,⽽分⼦标记则有⼏个甚⾄于上千个。
分⼦标记越多，则所构建的图谱就越达到最⾼限度。
构建达到最⾼限度图谱是RFLP研讨的主重要的条⽬标之⼀。
使⽤随机引物扩增寻觅多态性DNA断⽚可作为分⼦标记。
这种办法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。
尽管RAPD技术诞⽣的时间很短, 但因为其独有特别的检验测定DNA多态性的形式以及迅速、简单⽅便的独特的地⽅,使这个技术已渗透于基因组研讨的多种⽅⾯。
该RAPD技术树⽴于PCR技术基础上,它是利⽤⼀系列(⼀般数百个)不⼀样的随机排列碱基顺着次序的寡聚核苷酸单链(⼀般为10聚体)为引物,对所研讨基因组DNA施⾏PCR扩增.聚丙烯酰胺或⽯花胶糖电泳离合,经EB染⾊或放射性⾃显影来检验测定扩增加产量物DNA断⽚的多态性,这些个扩增加产量物DNA断⽚的多态性反映了基因组相应地区范围的DNA多态性。
RAPD原理及操作
5.结果分析
观察各个样品间扩增条带的异同；
分析样品的相似性系数和亲缘关系，
作出它们的亲缘关系树状图。
1个反应的体积
18µl 2.5 µl 0.5µl 1.0µl 1.0 µl 2.0 µl 0.2 µl 25µl
终浓度
1× 2 mM 0.1mM 0.2 µM 10-20 ng 1U
3.RAPD-PCR
扩增程序为： 94℃，5’（预变性，保证模板能够彻底变性）； 94℃，40” → 38℃，1’ → 72℃，1’30”（35个循环）； 72℃ ，10’（后延伸，保证所有片段扩增完全）
RAPD技术的特点
1. 引物长度：常规PCR的引物长度为18-24nt（引物需要足够长， 保证序列独特性），但RAPD反应中所用的引物比较短(8-10nt)。 2. 扩增反应中只用一个引物，但实际起到两个引物的作用 。 3. DNA用量少，一般1ng/1µL 。
4. 退火温度较低（35－40℃），以利于多态性的检出。
表性技术为EST标记、SNP标记等。
RAPD标记的基本原理
1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息 的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性 DNA 标记
(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)，在种植资源研究、杂
种鉴定与遗传作图等方面有广泛应用。
RAPD 的具体原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链 (8-10nt) 为引物，以组织中分离出来的基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增。随机引物在基因组 DNA序列上有其特定结合位点， 一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变， 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增 产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电 泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组 相应区域DNA的多态性。
RAPD分子标记技术
Normal concentrations are shown in yellow text. M = A size standard
Lowering Magnesium ion concentration results in loss of the largest fragment visible in lanes 2-7
RAPD
Primers point away from each other, so amplification won’t happen
Template DNA
RAPD
Template DNA
Primers point in the same direction, so amplification won’t happen
位点特异的 PCR标记方法
RAPD标记
1
RAPD标记简介和原理 标记的原理 RAPD标记的操作步骤 RAPD标记特点及应用
2
3
1
RAPD标记简介和原理
（1）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）
简介：RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的
4mM MgCl2 4mM MgCl2 2mM MgCl2 1.2 U Taq 0.6 U Taq 1.2 U Taq 5 pM OPA-16 10 pM OPA-16 10 pM OPA-16
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线 粒 体 具 有 独 立 于 染 色 体 之 外 的遗 传 物 质 ， 够 进 行 能 Ｄ ＮＡ 的复 制 、 录 和 翻 译 。然 而 线 粒 体 基 因 组 仅 编 码 提 供 转 线 粒 体 自身 生物 发 生 和 各 项 生 命 功 能 所 需 的 部分 遗 传 信 息 ， 物种 的其 余 绝 大多 数 遗 传 信 息 来 源 于 核基 因组 。 因 此 ， 细 在 胞 核 与线 粒 体 共 进 化 的大 背 景 下 ， 粒 体 逐 步 具 备 了独 立 的 线 遗传 和 生 物化 学 特 征 ， 些特 征 在 植 物界 尤 为 显 著 。植 物 这 ］ 线粒 体 ＤＮ 大小 介于 ２０ ５０ ｂ 较 动 物 的线 粒 体 Ｄ Ａ ０ ￣２ ０ ｋ ， ＮＡ 大 １ ～ １０ ， 存 在 形 式 多 样 ， 构 复 杂 。有 时 同一 物 ５ ５倍 其 结 ］ 种 的不 同 品种 ， 至 同 一 物 种 的 不 同 株 系 ， 粒 体 Ｄ 乃 线 ＮＡ 都 可能 存 在 很 大 的 差 异 。 造 成 线 粒 体 ＤＮＡ 结 构 复 杂 的 主 要
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没有 一 种 较 好 的 能 够 对 植 物 线粒 体 基 因 表达 进 行 分 析 的方 法 。 本 文 依 据 线 粒 体 ＲＮ 的 自身 特 点 ， 已 用 于 分 析 Ａ 对 真核 ｍ Ａ 的差 展 方 法 进 行 了 改 进 。采 用 随 机 六 聚 体 引 物 取 代 ｏｉ （Ｔ） ， 而 将 线 粒 体 Ｒ Ａ 及 其 他 各 类 无 ＲＮ ｌｏ ｄ ｎ 从 ｇ Ｎ ｐｌ（ 尾 的 ｍＲ ｏｙ Ａ） ＮＡ 纳 人 到 可 直 接研 究 的范 围 ， 展 了一 种 适用 于线 粒 体 基 因表 达 分 析 的方 法 。 发
Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｌ ｏｌ ｅ ｅ ｏ Ｓ ｉｎ ｅ ， ｈ ｎＵｎ￣ ｒｉ Ｗｕ ａ ３ ０ ２ Ｃ ｉ ） ｃ ｃｓ Ｗｕ ａ ｉ ｓ ｙ， ｈ ｎ ４ ０ ７ ， ｈ ￣ ｅ ｔ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｓ ｖ ｒ １ ｅ ｈ ｉｕ ｓａ ｅ ａ ａ ｌｂ ｅｉ ｅ ｅ ｔ ｇ ａ ｉｔ ｎ ｎｇ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｘ ｒ ｓ ｎ ｂ ｔ ｅ ｉｆ ｒ ｎ ａ ｌｓ ｓ ｃ ｓ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｅ ａ ｔｃ ｎ ｑ ｅ ｒ ｖ ｉ ｌ ｎ ｄ ｔ ｃ ｎ ｖ ｒａ ｉ ｓｉ ｅ ｅｅ ｐ ｅ ｓ ｅ ｗｅ ｎ ｄ ｆｅ ｅ ｔ ｍｐ ｅ ． ｕ ｈ ａ ａ ｉ ｏ Ｅ ｏ ｓ
武汉 大 学 植 物 发 育生 物 学 教 育 部 重 点 宴验 室 ， 汉 大 学 生 命科 学 学 院 遗 传研 究 所 ， 汉 ４ ０ ７） 武 武 ３ ０ ２
摘
要 ： 于植 物 线 粒 体 Ｄ 由 ＮＡ 分 子 结 构 复 杂 ， 在 与 细 胞 核 共 进 化 的 过 程 中形 成 了 自 己 独 特 的表 达 系 统 ， 今 仍 并 迄