免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤Word版
免疫荧光双标操作方法及注意事项样本
在同一组织细胞标本上需要同步检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素抗体(如抗A和抗B)以恰当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合荧光抗体，在荧光显微镜下分别选取两种相应激发滤片观测，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但敏捷度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余第一抗体后，再用两种不同荧光素分别标记第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余第二抗体，后在荧光显微镜下分别选取两种相应激发滤片观测，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必要来源于不同种属，且荧光标记第二抗体种属必要与第一抗体种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水解决，封闭和一抗孵育与其相似。
2、免疫荧光二抗使用不同荧光标记二抗孵育，孵育时间依照抗体工作浓度拟定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观测。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件允许，建议购买抗淬灭封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体孵育以及后续解决需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性也许会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后普通在1h内完毕观测，或于4℃保存4h，时间过长，也许会使荧光提前衰退。
2、每次实验均需设立如下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标经验之谈1、选用一抗时，规定来源于两种不同动物，我用是来源于家兔和大鼠抗体，二抗则是不同荧光信号标记，我用是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光细胞化学双重染色法
免疫荧光细胞化学双重染色法
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白―{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)
1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。
2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。
在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。
例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG 和生物素化―抗兔IgG。
进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。
孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。
其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。
此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。
换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。
若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。
（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。
（11）次日取出切片，室温下复温 30min。
（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。
（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。
（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。
贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
dab染色方法
dab染色方法DAB 染色方法啊，这可是个很有意思的玩意儿呢！你知道吗，它就像是一位神奇的魔法师，能让那些隐藏在细胞里的秘密一点点地显现出来。
咱先来说说 DAB 染色到底是咋回事儿。
简单来讲，它就是一种能让特定的物质显色的方法。
就好比你在黑夜里拿着手电筒，一下子就把你想找的东西给照亮了。
细胞里有那么多复杂的结构和成分，DAB染色就像是专门为我们打开这扇神秘大门的钥匙。
要进行 DAB 染色，那可得精心准备一番。
就像你要去参加一个重要的聚会，得好好打扮一下自己一样。
得准备好各种试剂，每个试剂都有它独特的作用，少了谁都不行呢。
然后就是一系列的操作步骤，可不能马虎，一步错步步错呀。
你想想看，把细胞样本放在那里，就像是把一个小宝贝放在摇篮里，然后我们小心翼翼地给它加上各种试剂，就像是给小宝贝盖上温暖的小毯子，喂它好吃的。
这过程多有趣呀！等完成了这些步骤，嘿，奇迹就出现了，那些原本看不见的东西一下子就出现在眼前了，是不是很神奇？DAB 染色的应用那可广泛了去了。
在医学研究里，它能帮医生们更好地了解疾病的发生和发展；在生物学研究中，它能让科学家们对生物的结构和功能有更深入的认识。
这就好像是给我们配上了一副超级厉害的眼镜，让我们能看清那些以前看不到的细微之处。
不过，可别以为 DAB 染色就是随随便便就能做好的哦。
这可得有耐心，有细心，还得有技术。
就像做饭一样，火候、调料都得掌握得恰到好处，不然做出来的菜可就不好吃啦。
要是不小心弄错了一步，那可能就前功尽弃啦，多可惜呀！而且啊，在进行 DAB 染色的时候，还得注意安全呢。
那些试剂可不能随便乱碰，不然可能会给自己带来麻烦哦。
这就像是走在路上要注意交通安全一样，可不能马虎大意。
总之呢，DAB 染色方法就是这样一个神奇又重要的技术。
它能让我们看到细胞世界里的精彩，能帮助我们解开一个又一个的谜团。
所以呀，如果你对生物学或者医学感兴趣，那可一定要好好了解一下DAB 染色方法哦，说不定你就会被它的魅力所吸引呢！难道不是吗？。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo—1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%—100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X-100透化2—5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5％BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里,4度过夜9、1×PBS洗3次,每次10分钟10、加二抗(用1％BSA稀释)30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛,0.2%Triton，5％BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1。
取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3。
0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4。
与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5。
一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好,PBS洗三遍。
6。
二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7。
最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
dab染色方法流程
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1. 切片脱蜡和水化。
用二甲苯脱蜡三次，每次 5 分钟。
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制备细胞爬片
1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。
再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。
将培养皿（6孔细胞培养板）置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。
3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。
4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。
5、加 10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定 10～15min。
6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。
7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。
8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。
将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。
免疫荧光双染
用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案
1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 10～15min。
（细胞爬片固定后，以下步
骤一样）
2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切
片，3×5分钟。
PBS液是用来漂洗和稀释的。
其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。
3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。
（若是要检测的抗
原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟
4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。
（37℃）（一抗前不洗，只甩干）
5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下
相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。
当用荧光标记的原始抗体用于直接免疫染色（一度抗体）时，你可以跳过用二度抗体的间接免疫染色方法（二度抗体）的步骤（6）。
（4℃过夜最好）在PBS液或TBS中漂洗3×5分钟。
6)二度抗体：用一对不同荧光素标记﹡﹡的二度抗体﹡，用以结合相应物种原
始抗体的IgG，在室温下孵化切片60分钟，在PBS中漂洗3×5分钟。
7)复染：如果必要进行核染色如用DAPI（5μg/ml PBS中5min）。
在PBS中漂
洗切片3×5分钟。
8)选择性：为了阻止荧光标记从抗体上脱离，也为了更长的保存以保护染色，
在水溶性媒介使用前，推荐在含4%甲醛的PBS液中简短的处理（1-3分钟）。
在PBS中漂洗切片2×3分钟。
9)锚定：对于荧光显微镜，用抗褪色媒介锚定切片。
注释：﹡一般来说，两种二度抗体来自同一物种进行双/多标记
﹡﹡当用生物素标记的二度抗体时，在进行复染色（步骤7）前，应首先用荧光标记的（链）亲和素的ABC技术（见6.2.1章节）来观察生物素。
细胞爬片的免疫化学染色法（DAB染色）
1、在细胞爬片上加0.03% Triton X-100 水溶液处理15min。
（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略）
2、吸除0.03% Triton X-100，加3%H2O2孵育10min。
3、吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封闭30～60min。
PBS 洗5min。
4、吸除PBS，分别滴加相应的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS 液稀释到合适滴度），置于37℃孵育1h，或置于4℃冰箱中
过夜。
阴性对照片此步用PBS 替代一抗。
5、吸去一抗，PBS 漂洗3 次，每次5min。
滴加山羊抗鼠的IgG 抗体-fitc多聚体，37℃孵育30min。
6、 PBS 漂洗3 次，每次5min。
新鲜配制DAB 显色液，滴加后作用3～5min，置于显微镜下观察染色结果。
7、双蒸水漂洗后，滴加苏木精染液，染色10min。
(1-2分钟就够了染得太浅要再染!)
8、双蒸水漂洗后，滴加0.5%HCl-70%Ethanol（乙醇），作用1min 以分色。
9、双蒸水漂洗后，滴加1%NaHCO3 作用3～5min 以蓝化细胞核。
10、双蒸水漂洗1min，然后将细胞爬片经70%、80%、95%、100%、100%乙醇各1～2min 梯度脱水。
11、入二甲苯透明2 次，每次5min。
(可以1-2分钟)
12、室温下晾干，用中性树胶封片。
13、显微镜下观察染色结果，并拍照。
（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。