细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
1. 细胞一定要贴在玻片上（最好可以放入24孔板），为后面照像打基础。
细胞密度适中，大约60-75%满片即
可，否则容易脱片。
2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。
（以下各步骤切毋使玻片干燥）
3. PBS冲洗
4. 0.1%Triton作用20分钟
5. PBS冲洗
6. 10%正常血清封闭10分钟
7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗
体从较高处落到片子上，以分布均匀。
抗体稀释度1：60，较常用！
8. PBS冲洗4次，各5分钟
9加入荧光二抗，室温30分钟。
抗体稀释度1：400，较常用！
10. 同8。
11. 90%甘油封片。
也很关键阿，多封几次才有体会。
12. 避光保存，或到显微镜下观察。
0.1%Triton和山羊血清。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
细胞免疫荧光步骤[1](干货分享)
](https://img.taocdn.com/s3/m/ba3d4b9c336c1eb91b375d28.png)
细胞免疫荧光步骤方法一:1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片)2.然后在4％PＦA里面室温下固定30分钟，ＰBＳ洗两次，0.1％TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的pａrａfilm,在上面滴上稀释在1％ＢSＡ/TＢＳ中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片３0ul 足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育３0分钟，然后在PBＳ里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上ｍounting medium(大约每个玻璃片加10uｌ)，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WＢ检测一下你的抗体,看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rａbｂiｔ和rａt的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是ｄonｋｅy ａｎtｉ—rabbiｔ－FITC（绿）和doｎkey anti-ｒat-Ｔｅx－Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是1０％的正常donｋey血清.5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作.方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片,还有直接在2４welｌ/12well/９6wｅll中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
细胞免疫荧光的方法
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤细胞免疫荧光技术是一种能够检测活细胞内特定蛋白质分布的技术，常用于免疫组化分析中。
该技术重点在于使用特定抗体与荧光染料结合，达到明显的荧光信号来检测活细胞内某些蛋白质标识。
以下是细胞免疫荧光技术的主要步骤：1、培养或固定活细胞首先需要对活体细胞培养或固定。
一般选择在培养皿或载玻片上将密集的细胞生长于培养液基质中，可以在日后的荧光显微镜下更加清晰的观察细胞结构及变化。
2、组织切片或钝化在一些研究工作中，如动物实验或组织切片中，可能需要先进行组织切片或尸解固定。
组织切片需要先进行固定处理，如使用琼脂糖进行完整的埋嵌固化，然后进行蜡加热染色处理，裁切成薄片。
或者可以做成冰冻切片，操作上更为简单。
另外，钝化细胞可以使用不优化溶液，其中的表面抗原质已经被消除。
这不仅可以减少非特异性信号，而且可以提高特异性状态的细胞荧光信号。
3、细胞膜的处理在进行免疫染色之前，还需要对细胞膜进行处理。
例如，可以使用牛血清蛋白或非离子界面活性剂来堵塞非特异性的结合位点。
这可以减少非特异性抗体与未知结合物的竞争，提高特异性免疫染色的精度。
4、初级抗体与荧光染料的结合细胞内需要检测的蛋白质必须有一个感兴趣的特定蛋白质抗体。
该抗体允许特定的蛋白质标记。
将特定抗体与荧光染料结合后，允许可见光下的荧光染色信号。
此类荧光染料通常具有比较好的耐用性和较高的量子产率，如荧光色素FITC和荧光色素PE等。
5、清洗和固定将免疫荧光的样品进行严格的洗涤，以去除非特异性的结合物。
洗涤过程可以在紫外光下观察到荧光信号的信噪比。
最终用4%多面固聚醛溶液对洗涤后的样品进行固定处理，以确保样品的可保存性，并且可以长时间保存参考质量以后的荧光染色结果。
6、镜下观察荧光染色的样品在显微镜下观察，可以更加清楚的去判断每个活体细胞的染色情况。
结果分为阳性（显示为荧光亮点或分布）、阴性（显示为黑色或无明显荧光）和疑似阳性（显示为劣质荧光或其他滞留现象）。
【高中生物】三种细胞免疫荧光染色操作具体步骤
【高中生物】三种细胞免疫荧光染色操作具体步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，以下主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
[ZO-1的免疫荧光]步骤如下：1.当细胞生长并在盖板上融合到95%-100%时，将其从培养箱中取出。
2、用预温的1×pbs洗3次，每次10分钟3.在室温下固定4%的甲醛20-30分钟4、1×pbs洗3次，每次10分钟5.0.2%Triton X-100渗透2-5分钟6、1×pbs洗3次，每次10分钟7.5%牛血清白蛋白在室温下密封30分钟8、加一抗(用1%bsa稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×10分钟内清洗3次10、加二抗(用1%bsa稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗涤3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛、0.2%Triton和5%BSA均使用1×PBS稀释液从大鼠分离的t细胞能否直接做细胞免疫荧光[细胞攀爬片的免疫荧光]步骤：1.取出细胞爬片，放入35mm或60mm用过的细胞培养皿中，PBS洗涤三次。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加pbs不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加pbs，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
用2.4%冷多聚甲醛固定20分钟，用PBS清洗三次。
3.0.2%tritonx-100通透10分钟，pbs洗三遍。
4.将与二级抗体相同宿主的血清阻断30分钟，并洗涤PBS三次。
5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，pbs洗三遍。
6.二级抗体应在室温下用PBS洗涤三次2小时（避光），或37℃洗涤1.5小时。
7.最好用dapi染核，然后直接照荧光片。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光
1. 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。
2. 离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。
3. 离心、吸去固定液，用15 ml 4℃PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS 再次洗涤细胞。
4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5×106细胞。
5. 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。
6. 用4℃PBS稀释细胞和抗体至15 ml。
7. 离心，吸去PBS，以4℃PBS重悬细胞，重复1次。
8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5×106细胞用250 μl 抗体足够。
9. 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。
10. 除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。
11. 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。
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细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
简单实验步骤如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min＊3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2＊5min
6.羊血清封闭：３７度，２０分钟
７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时
８.４度PBS洗净，３min＊５次
９.二抗３７度小于一小时
１０.３７度PBS洗净，３＊５min
凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×10６～１×10７／ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5～7天)
（二）试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度5％)
4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖20g (终浓度2％)
甲醛10ml
NaN３0.2g (终浓度0.02％)
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. D PBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度5％)
4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖20g (终浓度2％)
甲醛10ml
NaN３0.2g (终浓度0.02％)
严重同意楼上的讲解。
我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。
我想请问楼上：NaN３哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？
我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4％的甲醛室温固定20－30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95％甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适
各位同仁:
我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。
不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。
请高手指教。
万分感谢！
能发一个邮件更好，再一次感谢！
我的E-mail：********************.cn
抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间
bu不是原创
我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。
（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少）
顶一下
我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理？
我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法，找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。
不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定。