22章-2 基因功能研究1---基因打靶和转基因

P Restriction enzyme
Neo
HSV-Tk
Targeting vector
ES cell
同源重组时可能遇到哪些问题，筛选标志在这个过程中发挥什么样的作用？
Two ways for Neo gene insertion
Homologous Recombination
Neo P53 gene in ES cells HSV-Tk
a).基因敲除ES细胞注射入胚泡
Inject the gene knocked-out ES cells into a blastocyst. original inner cell mass
Mate→3 days Provides normal blastocyst Normal Mouse embryo Chimeric Blastocyst
第二十二章
第三节 基因的生物学功能鉴定技术
Strategies for analyzing gene function 教师：王华 单位：吉 林 大 学 基础医学院 分子生物学教研室
电话：85619369 (L)
对题目的解析：
•基因的功能
Gene DNA
基本思路：
•在DNA水平的技术 — 使相应基因缺失而失活: 基因敲除 — 细胞或动物获得新基因、或 额外拷贝的基因：转基因技术 •在mRNA水平的技术：封闭或降解mRNA
单核苷酸 类似物是 无毒的
细胞生长良好
但如果细胞中如果有HSV-TK 基 因的表达，即存在TK (thymidine kinase)，单核苷酸类似物将被其 磷酸化成有毒的产物…
细胞死亡
阴性筛选目的：
用打靶载体转染ES细胞时，我们只需要同源部分重组入 ES cell的genome,而Tk基因等载体的其它部分是不可以进 入ES cell的genome(by随机重组)。用单核苷酸类似物筛选 转染后的细胞，存活的细胞基本上不含载体的非目的序列
(2) As animal models ：
HBV transgenic mice
(3) 改良动物（植物）品种？
P Targeting vector
基因敲除载体的特点： *
•待敲除基因的同源臂序列 •阳性筛选标记基因 •阴性筛选标记基因
打靶载体
问题：如何构建打靶载体？
> 基因敲除载体的构建过程：了解
待敲除基因
P P Target gene
Recombinant cloning vector Cloning vector
(3)
(4) 检测子代是否 存在转基因 (5)
Psuedopregnant mouse
通过杂合子后代 交配，获得纯合 子转基因动物
转基因动物的应用
(1) 基因功能的研究
1982年美国哈佛大学的一个科学家小组，将大鼠 的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白基因 的启动子顺序连接，再引入质粒中。科学家把这种 重组的质粒直接注射入小鼠受精卵中，经过充分发 育后终于分娩出了21小鼠，其中有七只带有融合基 因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，超过同 窝无融合基因小鼠（平均体重29g）的1.5倍，这就 是闻名于世的“超级小鼠”。
（二）基因敲除的基本流程*
•1 构建基因敲除载体 •2 将基因敲除载体导入ES细胞，通过同源重组建立 基因敲除的胚胎干细胞杂合子 •3 然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有特定基 因缺陷的杂合子小鼠。
??? a).基因敲除ES细胞注射入胚泡 b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中 c). 嵌合体的杂交育种获得杂合子小鼠
（一） 基因敲除的定义
•利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色 体上剔除的过程。
Genomic DNA:
Targeting DNA fragment: Homologous arm sequence
Genomic DNA/gene knocked out: Lost its original function
一般是嘌呤(A 或G)
Kozak sequence •目的基因:起始密码和终止密码 •Kozak 序列：是核糖体高效率起始翻译所必需的。 +4G 和-6G 对于核糖体识别AUG 有显著的促进作用
（二）用转基因动物技术研究基因的功能
* 转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因
事实上，目前至少500种基因已经获得了基因敲除小鼠！
基因敲除小鼠工程
2006年，
•美国NIH推出knockout Mouse Project (KOMP) •将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因 •计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库 •此计划与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重复工作
（三）基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管* 肿瘤基因
“ alive test tubes”.
Gene knockout mice is a powerful tool for studying gene function.
（三）基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管*
小鼠受精卵发育第4～5天的胚泡细胞； Brown mouse
基因敲除载体
能在体外培养，具有发育的全能性。
ES cell (Embryonic stem cell)
为什么需要将打靶载体线性化？
（二）基因敲除的基本流程*
•1 构建基因敲除载体 •2 将基因敲除载体导入ES细胞：重组臵换＊
Homologous arms
Inject
b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中
Implant into uterus of a pseudopregnant foster mother
Psuedopregnant black mouse
Neo (+/-)
Test offspring for presence of gene by PCR
* transgenic animal 的制备步骤：
基本流程*： (1) 转基因表达载体的构建；
Enhancer
P
transgenic gene
NeoR
* transgenic animal 的制备步骤：
基本流程*： (1) 转基因表达载体的构建；
pronuclei
(2) 外源基因的导入受精卵（或ES cell）细胞核内；
两种方法： 前核法
胚胎干细胞法
Fertilized egg
ES cells
* transgenic animal 的制备步骤：
(1) 转基因表达载体的构建； (2) 外源基因的导入受精卵（或ES cell）细胞核内； (3) 上述转基因细胞移植入假孕小鼠的子宫腔中；
•转基因是随机整合到染色体上。 •一般情况下，转基因杂合子的几 率在10-20% 以下
mRNA RNA
Protein
—反义RNA， RNAi
• 利用生物信息学数据库预测的基因功能
基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，这对于我们深 入理解疾病的发生机理、探索新的治疗途径非常重要！
一、 使体内原有基因缺失的技术: 基因敲除 (gene knock-out)
美国犹他大学Eccles 人类遗传学研究所 马里奥· 卡佩奇 Mario R. Capecchi 英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院 马丁· 埃文斯 Martin J. Evans 美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院 奥利弗· 史密斯 Oliver Smithies
Random Insertion
P53 gene
P53 gene
Other sites
10-5-10-6
P53 gene Neo gene P53 gene is replaced by Neo gene. Cells are resistant to both neomycin and gancyclovir
Neo
（+/+）
（+/-）
（+/-）
（-/-）
•4 Mating heterozygous offsprings to produce homozygous gene knocked-out strain
小结：基因敲除的基本流程*
2
3
嵌合体 与阴性小鼠 交配
1 4. 基因敲除的纯合子小鼠
杂合子小鼠
“人鼠”
Produce humanize antibodies
如何理解基因剔除过程其实就是一个经过改造的基因敲入的过程？
二、外源基因导入受体细胞或生物体内
•基因功能获得策略 •本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中， 使其获得新的或更高水平的表达，然后通过细胞 或个体生物性状的变化来研究基因功能。 方法： （一）细胞水平：细胞的基因转染 （二）动物水平：转基因动物
HSV-Tk gene
Neo gene
P53 gene is not replaced. Cells are resistant to neomycin but sensitive to gancyclovir.
阴性筛选标记基因（HSV-Tk）的筛选原理
细胞的培养基含单核苷酸类似物 (gancyclovir)

基因敲除（gene knockout）*
•利用DNA同源重组的原理，在ES细胞中定 点破坏一条染色体上的內源基因。 •然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有 特定基因缺陷的杂合子小鼠。 •最后通过遗传育种最终获得目的基因缺陷 的纯合子个体。